表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法。反转录获得传染性法氏囊病毒基因组ｃＤＮＡ，ＰＣＲ扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达ｐＣＩ－ｎｅｏ构建成重组表达质粒。在Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　　２０００介导下转染Ｖｅｒｏ细胞，在Ｇ４１８的抗性下，通过极限稀释法克隆单细胞，经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　　ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　ｂｌｏｔ、ＩＦＡ／ＩＰＭＡ检测，获得含目的基因的克隆化细胞系，经反复传代培养后不丢失。这些细胞系可作为研究传染性法氏囊病毒基因编码蛋白对宿主细胞基因表达调控的载体，以及将表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白应用于传染性法氏囊病的免疫接种。本发明专利技术应用基因工程技术、细胞重组技术制备表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白的永生细胞，具有重复性强、稳定性好，再生能力强等特点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表达传染性法氏囊病毒基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于它的步骤如下：１）自传染性法氏囊病毒抽提病毒ＲＮＡ，长距离一步法ＲＴ－ＰＣＲ扩增病毒全长ｃＤＮＡ，并以此为模板ＰＣＲ扩增不同编码蛋白的基因片段与哺乳动物细胞真核表达ｐ ＣＩ－ｎｅｏ构建表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ－Ａ、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２４３、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ５、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ３、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２（ＣΔ６０）、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２（ＣΔ２５）、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２（ＣΔ１８）、ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ２（ＣΔ１１）和ｐＣＩ－ｎｅｏ－ＶＰ１，经４２℃热击转化ＣａＣｌ↓［２］法制备的大肠杆菌Ｔｏｐ１０感受态细胞；２）用Ｌｕｒｉａ－ＢｅｒｔａｎｉＭｅｄｉｕｍ作为基础培养基，各培养１－３ｍｌ浓度为１－ １．５ＯＤ↓［６００］值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；３）用含１０－１５％小牛血清的ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ作为基础培养基，各重组质粒经Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ稀释后在 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００介导下转染９０－９５％融合的生长活力旺盛的单层Ｖｅｒｏ细胞；４）在含５００μｇ／ｍｌ浓度Ｇ４１８的ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；　 　５）单克隆化细胞经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和ＩＦＡ／ＩＰＭＡ检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，叶菊秀，陈庆新，郑肖娟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]