一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法技术

本发明专利技术提供了一种阿仑膦酸钠的高灵敏度宽检测范围荧光检测新方法，先利用铜离子对寡聚核苷酸‑荧光银纳米簇中银纳米簇的猝灭作用，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离寡聚核苷酸‑荧光银纳米簇，从而使银纳米簇的荧光恢复，通过监测阿仑膦酸钠浓度对铜离子介导的DNA‑AgNCs复合探针的荧光强度的改变，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠含量所做标准曲线计算阿仑膦酸钠含量。本发明专利技术方法适用于样品（药物制剂或生物样品如尿样、血清样本等）中阿仑膦酸钠含量的检测，具有宽线性范围、高灵敏度、少干扰，省时、绿色安全等优点，适合大规模推广。

A new fluorescence detection method for Takama Mihiro detection range of alendronate

The invention provides a Alondronate high sensitivity wide detection range of fluorescence detection method, first use the quenching effect of copper ion on oligonucleotide fluorescent silver nanoclusters of silver nanoclusters, reduce the background signal, and then the sample of Aiendronate sodium and copper ions combine to form composite, made of copper ion from oligonucleotide fluorescent silver nanoclusters, so that the fluorescent silver nanoclusters by monitoring the recovery of alendronate sodium concentration on fluorescence intensity of DNA AgNCs composite probe of copper ion mediated changes in the fluorescence recovery according to its degree and A Lun phosphonic acid sodium content by standard curve to calculate the alendronate sodium content. The method is suitable for the detection of alendronate content in samples (drug preparations or biological samples, such as urine and serum samples), and has the advantages of wide linear range, high sensitivity, less interference, time saving, green and safety, etc., and is suitable for large-scale promotion.

【技术实现步骤摘要】
一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法
本专利技术涉及阿仑膦酸钠荧光检测，具体涉及一种阿仑膦酸钠的高灵敏宽检测范围荧光检测新方法。
技术介绍
阿仑膦酸钠(Alendronatesodium，ALDS)，化学名为(4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸单钠盐三水合物，是第三代氨基二膦酸盐类骨吸收抑制剂。阿仑膦酸钠与骨内羟基磷灰石有很强亲和力，能进入骨基质羟基磷灰石晶体中抑制破骨细胞活性，并通过成骨细胞间接抑制骨吸收，临床上主要用于治疗骨质疏松症和变形性骨炎。由于阿仑膦酸钠的分子结构中含有两个膦酸基团，极性强，易电离，无发色基团，因而不能直接用常规的紫外检测器或荧光检测器测定该药物含量。现行的国家标准(WS1-(X-312)-2004Z[18])中阿仑膦酸钠片含量采用测量误差较大的钼蓝比色法，不利于控制药品的质量。李赟等人在《药学与临床研究》杂志报道了Cu2+络合反相离子对色谱-紫外检测法测定阿仑膦酸钠片的含量，但该方法需要将阿仑膦酸钠与Cu2+剧烈振摇40min后形成较好的复合物，而且灵敏度差，检测线性范围较窄，不适用于生物样品的检测。另有文献报道采用高效液相色谱法来检测药物制剂或生物样品中阿仑膦酸钠的含量，由于阿仑膦酸钠不具有生色基团，需要先用邻苯二甲醛、重氮甲烷、氯甲酸芴等衍生剂经过衍生化生成紫外吸收基团，该方法需要经过繁琐的固相萃取过程，操作复杂，同时重氮甲烷具有爆炸性和毒性，存在安全隐患。因此，开发操作简便、快速、灵敏度高、检测线性范围更广的阿仑膦酸钠检测新方法具有十分重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种阿仑膦酸钠的荧光检测新方法，该方法操作简单，且灵敏度高、检测范围宽。本专利技术的目的是这样实现的：一种阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于：先利用铜离子(Cu2+)猝灭寡聚核苷酸稳定的银纳米簇(以下简称DNA-AgNCs)的荧光，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子通过配位结合形成复合物使得铜离子远离DNA-AgNCs探针，从而使DNA-AgNCs的荧光恢复，其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度呈线性关系，做标准曲线计算样品中阿仑膦酸钠的含量。本专利技术阿仑膦酸钠的检测方法，其特征在于：将Cu2+、DNA-AgNCs、含阿仑膦酸钠的样品在PB缓冲液中反应，反应结束后在荧光分光光度计上扫描200-800nm的最大激发波长与最大发射波长，同时做空白试验；根据最大激发波长下，最大发射波长处的荧光强度变化与阿仑膦酸钠标准品浓度所做的标准曲线，即可算出样品中阿仑膦酸钠的含量。作为优化，上述阿仑膦酸钠的检测方法，其特征在于：将DNA-AgNCs、Cu2+、阿仑膦酸钠标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为25-1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为5.8-8.0。作为进一步优化，上述阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于：将DNA-AgNCs、Cu2+、阿仑膦酸钠标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为500-1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为7.0-8.0。作为更进一步优化，上述阿仑膦酸钠的荧光检测方法，其特征在于，采用如下步骤：先将阿仑膦酸钠标准品加入到Cu2+(800nmol/L)和PB缓冲液(pH7.4)混合溶液中混匀，室温下静置15min；然后再加入DNA-AgNCs混匀，室温下静置20min；之后在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640nm处的荧光强度进行定量，同时做空白试验；所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：Y＝0.02382X+1.086(标准曲线方程)式中：Y为相对荧光强度(F/F0，其中F表示有阿仑膦酸钠时的荧光强度，F0表示没有阿仑膦酸钠时的荧光强度)；X为阿仑膦酸钠标准品的浓度(单位：μmol/L)。一种阿仑膦酸钠的荧光检测方法，包括空白试验、样品检测及计算结果步骤，其特征在于：(1)空白试验：在1.5mL离心管中依次加入40μLCu2+(800nmol/L)、40μLPB缓冲液(pH7.4)与40μLDNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的荧光强度，测定最大发射波长640nm处的荧光强度作为F0；(2)样品测定：在1.5mL离心管中依次加入40μLCu2+(800nmol/L)、40μLPB缓冲液(pH7.4)与40μL含阿仑膦酸钠的样品溶液涡旋混匀，静置15min，再加入40μLDNA-AgNCs(310nmol/L)，加水补充至400μL，涡旋混匀，室温下静置20min；在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605-750nm的最大荧光强度，测定最大发射波长640nm处的荧光强度F；(3)计算结果所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：Y＝0.02382X+1.086(标准曲线方程)式中：Y为相对荧光强度(F/F0)；X为阿仑膦酸钠的浓度(单位：μmol/L)。本专利技术所述原料及试剂均为市售产品。本专利技术PB(PhosphateBuffer)缓冲液为本领域所熟知的磷酸盐缓冲液。本专利技术DNA-AgNCs的合成方法为：将DNA溶液中加入AgNO3溶液，在PB缓冲液中涡旋混匀，避光孵育，再加入与AgNO3等摩尔浓度的NaBH4溶液反应制得DNA-AgNCs。本专利技术中寡聚核苷酸作为制备荧光银纳米簇的模板，它的序列为5’-GGCAGGTTGGGGTGACTAAAAACCCTTAATCCCC-3’(Zhang,P.,Wang,Y.,Chang,Y.,Xiong,Z.H.,Huang,C.Z.,2013.BiosensBioelectron.49,433-437.)。有益效果：本专利技术先利用铜离子猝灭DNA-AgNCs的荧光，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离DNA-AgNCs探针，从而使探针荧光恢复，通过监测阿仑膦酸钠对铜离子介导的DNA-AgNCs探针的荧光强度的改变，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度所做标准曲线，建立了一种低背景信号、高信噪比、快速简便的荧光分析新方法，对样品中阿仑膦酸钠含量实现高灵敏、高选择性检测。本专利技术方法不仅适用于药物制剂和生物样品中阿仑膦酸钠含量的检测，而且片剂辅料和生物样品中其他可能共存的物质如尿素、淀粉、甘露醇、葡萄糖、钠离子、钙离子、镁离子、钾离子、硝酸根离子、硫酸根离子等干扰物质，对检测结果影响小，即使干扰物为阿仑膦酸钠浓度的100倍时其相对荧光强度也不会发生明显改变，方法实用性较强；尤其是样品中阿仑膦酸钠的浓度在0.0008-200μmol/L范围内时，阿仑膦酸钠含量与体系的荧光强度呈良好的线性关系(R2＝0.9920)，标准曲线方程为Y＝0.02382X+1.086。本专利技术方法用于阿仑膦酸钠片中阿仑膦酸钠的含量检测，RSD为0.70-1.3％，加标回收率为103.5-110.0％；用于尿样中阿仑膦酸钠含量检测，RSD为1.1-1.7％，加标回收率为90.90-98.80％；用于血清样本中阿仑膦酸钠含量检测，RSD为0.40-1.8％，其加标回收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿仑膦酸钠的荧光检测新方法，其特征在于：先利用铜离子对寡聚核苷酸‑荧光银纳米簇中银纳米簇荧光的猝灭作用，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离寡聚核苷酸‑银纳米簇，银纳米簇荧光得以恢复，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度所做标准曲线计算样品中阿仑膦酸钠的含量。

【技术特征摘要】
1.一种阿仑膦酸钠的荧光检测新方法，其特征在于：先利用铜离子对寡聚核苷酸-荧光银纳米簇中银纳米簇荧光的猝灭作用，降低背景信号，然后样品中阿仑膦酸钠与铜离子结合形成复合物，使得铜离子远离寡聚核苷酸-银纳米簇，银纳米簇荧光得以恢复，根据其荧光恢复程度与阿仑膦酸钠浓度所做标准曲线计算样品中阿仑膦酸钠的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将Cu2+、DNA-AgNCs、含阿仑膦酸钠的样品在PB缓冲液中反应，反应结束后在荧光分光光度计上扫描200‒800nm范围内的荧光激发和发射光谱，同时做空白试验；根据最大激发波长下，最大发射波长处的荧光强度变化与阿仑膦酸钠浓度所做的标准曲线，即可算出样品中阿仑膦酸钠的含量。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：DNA-AgNCs、Cu2+、含阿仑膦酸钠的标准品在PB缓冲液中反应；所述Cu2+的浓度为25‒1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为5.8‒8.0。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Cu2+的浓度为500‒1200nmol/L；所述PB缓冲液的pH为7.0‒8.0。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用如下步骤：先将含阿仑膦酸钠的标准品加入到浓度为800nmol/L的Cu2+和pH7.4的PB缓冲液的混合溶液中混匀，室温下静置15min；然后再加入DNA-AgNCs混匀，室温下静置20min；之后在荧光分光光度计上设置最大激发波长为590nm，扫描605‒750nm的荧光发射光谱，以最大发射波长640nm处的荧光强度进行定量，同时做空白试验；所述样品中阿仑膦酸钠的含量按下式计算：Y=0.02382X...

【专利技术属性】
技术研发人员：张普，贾春燕，尚京川，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50