通过降低培养基的水活度生产杀虫真菌液体种子和分生孢子的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过降低培养基的水活度生产杀虫真菌液体种子和分生孢子的方法，通过在液体发酵的稳定生长期前调节液体培养基的水活度至０．９６～０．９８，制备得到包含杀虫真菌芽生孢子的发酵液作为液体种子，并可进一步进行固体发酵制备得到杀虫真菌分生孢子。本发明专利技术方法制备的优质液体种子最大生物量显著增加，产生的芽生孢子耐热、耐紫外辐射能力、毒力均明显提高。制备的分生孢子产孢量显著增加，耐热能力、耐紫外辐射能力和对目标害虫的毒力均明显提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杀虫真菌液体种子和分生孢子的制备方法。
技术介绍
杀虫真菌是一类重要的害虫生防微生物，菌种涉及接合菌亚门、半知菌亚门、子囊菌亚门和担子菌亚门。其中半知菌亚门的丝孢类真菌如白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌等是目前国内外用于害虫防治的重要杀虫真菌，已有多种商品制剂注册，用于防治同翅目、鳞翅目、鞘翅目、直翅目等许多重要的农林害虫，市场规模日益扩大，形成了良好的社会效益和经济效益。真菌杀虫剂的有效成分主要是真菌的繁殖体孢子，制备优良的孢子粉是形成制剂的前提。真菌孢子粉的制备主要经历了液体深层发酵、固体发酵和液固两相发酵。液体深层发酵主要产生的是芽生孢子，优点是制备便利、产量大，缺点是芽生孢子细胞壁薄，抗逆性能低，贮存性能差；固体发酵产生分生孢子，但存在制备周期长，条件难以控制，产生成本高；液固两相制备工艺主要是利用液体发酵制备芽生孢子和菌丝体，然后转接固体发酵制备分生孢子，从而大大缩短了制备周期，提高了产量，目前被很多国家(尤其是发展中国家)采用。如我国利用液固两相法制备球孢白僵菌分生孢子的工艺已较为成熟。然而，目前杀虫真菌发酵工艺的目标主要集中在提高孢子粉的产量上，而忽视了发酵条件对孢子生理状态的影响，结果制备的孢子粉“高产不高质”，存在抗逆性能差、不耐贮存，制剂加工性能和商品化性能低等不足。可见，在提高发酵产量的基础上，改良孢子的抗逆、耐热、贮存和毒力等质量性能，对促进真菌杀虫剂的产业具有重要价值。已有研究表明，适当降低培养基的水活度，可促进真菌胞内小分子量的多元醇如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、海藻糖等的积累，提高真菌的抗逆性能(耐干旱、耐贮藏、耐高温)和毒力。但由于降低培养基的水活度，在液体培养条件下可明显延迟生长速率，延长发酵周期；在固体条件下不仅延迟了菌体生长，而且产量降低明显(甚至比正常水活度条件下的产量降低1000倍以上)。目前，利用该方法制备杀虫真菌孢子仅有一例报道，即美国农业部利用KCI调整培养基的水活度进行液体发酵制备玫烟色拟青霉芽生孢子(专利号US5968808)。而利用水活度调节进行固体发酵和液固两相法发酵制备提高孢子质量和产量的方法，尚无实际应用的报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的一个目的在于提供一种杀虫真菌液体种子的制备方法，其通过适时调节液体培养基水活度而发酵制备优质液体种子。本专利技术的再一目的在于提供一种杀虫真菌分生孢子的制备方法，其通过液固两相发酵，在液体培养期间降低培养基的水活度制备液体种子，再进行固体发酵，制备分生孢子。本专利技术的另一个目的在于提供一种高产、高质(抗逆、耐贮藏、高毒力)的杀虫真菌分生孢子。本专利技术的还一个目的在于提供一种高产、高质(抗逆、耐贮藏、高毒力)的杀虫真菌液体种子。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种杀虫真菌液体种子的制备方法，其包括下述步骤将杀虫真菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长初始期、生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含杀虫真菌芽生孢子的液体种子。根据本专利技术的另一方面，提供了一种杀虫真菌分生孢子的制备方法其包括下述步骤1)杀虫真菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长初始期、生长延滞期和/或对数生长期，调节液体培养基的水活度至0.96～0.98，制备得到含杀虫真菌芽生孢子的液体种子；2)将上述步骤中制备的液体种子接种至固体培养基，通过固体发酵培养制备得到杀虫真菌分生孢子。以上所述芽生孢子(芽孢子)是从一个细胞以出芽方式形成的无性孢子，芽生孢子在一定条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。以上所述分生孢子是由菌丝的一部分转变成分生孢子梗，由分生孢子梗生出的孢子，分生孢子在适宜条件下又能萌发成单核菌丝或双核菌丝。本专利技术方法中，降低液体培养基水活度的方法为向培养基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl、KCl或葡萄糖等物质，优选向培养基中加入甘油或PEG200，最优选为甘油。本专利技术所述的方法适用于现有技术中所有的杀虫真菌，其中优选为丝孢类真菌，例如白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌等。在本专利技术的一个较佳实施例中，本专利技术制备液体种子和分生孢子的方法依次通过以下步骤实现1、菌株活化与培养；2、杀虫真菌液体种子的制备；3、固体发酵及分生孢子收集。在步骤1中，首先将杀虫真菌的保存菌株于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒温培养1周，然后见光培养3天产孢。SDAY培养基配方为葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，琼脂1.7，pH7.0左右。在步骤2中，将由步骤1得到的活化菌株定量接种到装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，于180rpm摇瓶培养3天，然后定量转接到发酵罐发酵培养。在液体发酵的不同阶段，通过流加方式加入一定量的灭菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物质，调节培养基水活度至Aw 0.98～0.96，继续培养至稳定生长期。步骤2也可以直接以摇瓶培养的液体种子进行固体发酵，在摇瓶培养的稳定生长期前通过添加灭菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物质降低培养基水活度至0.98～0.96，继续培养至稳定生长期。液体种子和液体发酵培养基配方为米粉3％，麦麸1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。培养基的水活度利用水活度测定仪(AquLab LITE)检测。在步骤3中，将生长稳定期的液体种子接种固体发酵培养基，接种比例为1∶1.5。然后进行固体反应器培养或浅盘发酵。发酵温度(品温)控制在25±1℃，72小时之内相对湿度在95％以上，并通气培养，避免搅动。72-120小时降低相对湿度至75％左右，并进行光照培养，待大量产孢后，于30℃进行干燥处理。定量取样检测含水量和产孢量。含水量测定利用水分快速测定仪(SH10A)，产孢量测定如下定量称取培养基质于一定体积的0.05％Tween-80溶液中，充分分散后，用血球计数板测定孢悬液的浓度，重复3次。然后根据发酵基物培养基含水量，计算5％含水量条件下的产孢量(个/g)。干燥后的基物利用孢子分离设备(MycoHarvester)收集孢子，收集的孢子纯度达1.0×1011孢子/克(含水量5％左右)。固体发酵培养基配方米粉50％，麦麸20％，谷壳30％。步骤3中的产孢量测定结果表明，低水活度来源的液体种子接种固体发酵后，分生孢子产量比正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子接种固体发酵后分生孢子(对照)产量明显提高；抗逆性和生物测定表明，步骤3中制备的分生孢子耐紫外辐射能力和耐热能力显著增强，毒力明显高于对照。本专利技术的优点在于1、本专利技术提供的杀虫真菌孢子制备方法，可通过在液体种子发酵过程中适时降低培养基的水活度，不仅使得杀虫真菌在液体培养条件下的生长速率提高，发酵周期缩短；而且与正常水活度下培养的液体种子相比，本专利技术的液体种子在固体培养条件下产孢量和活孢率均有所提高。2、本专利技术提供的液体种子显著提高了菌株生物量的积累，耐紫外辐射能力、耐热能力和毒力均显著高于正常水活度(Aw大于0.99)下培养的液体种子。3、该液体种子接种固体发酵培养基发酵制备的分生孢子，与对照相比，分生孢子产量、耐紫外辐射能力、耐热能力和毒力均明显提高。为了更好地理解本专利技术的本质，下面结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备杀虫真菌液体种子的方法，包括下述步骤：将杀虫真菌的活化菌株接种至液体培养基进行液体发酵培养，并在液体发酵的生长初始期、生长延滞期和／或对数生长期，调节液体培养基的水活度至０．９６～０．９８，制备得到含杀虫真菌芽生孢子的液体种子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张永军，裴炎，罗志兵，彭荣，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]