一种白菜瞬时转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种白菜瞬时转化的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：将目的基因导入农杆菌中，得到重组菌；用重组菌侵染白菜外植体，实现白菜的瞬时转化；目的基因通过重组载体导入农杆菌中；重组载体中用于启动目的基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子；用重组菌侵染白菜外植体的方法包括如下步骤：将OD600为0.1的重组菌与OD600为0.2的p19菌液混匀，得到混合菌液；用混合菌液侵染白菜子叶。本发明专利技术在烟草农杆菌注射方法的基础之上，对注射部位，注射农杆菌浓度，注射载体等方面进行调整，建立了适用于白菜的农杆菌注射渗透介导的瞬时表达体系。通过实验证明：本发明专利技术的方法可成功实现白菜瞬时转化，且有较高的转化效率。

A method of instant transformation of Chinese Cabbage

The present invention discloses a method of instant transformation of Chinese cabbage. The method of the invention comprises the following steps: the target gene was introduced into Agrobacterium, recombinant bacteria; recombinant bacteria infecting explants of Chinese cabbage cabbage, achieve instantaneous transformation; target gene by recombinant vector into Agrobacterium; recombinant vector for initiating gene expression promoter promoter for mannitol synthase; which comprises the following steps methods recombinant bacteria infection of cabbage explants: OD600 recombinant strains with OD600 0.1 P19 0.2 mixed bacteria, mixed bacteria liquid; mixed infection of cabbage cotyledon. Based on the injection method of Agrobacterium tumefaciens, the invention adjusts the injection site, injecting Agrobacterium concentration, and injecting vector, and establishes an instant expression system suitable for cabbage Agrobacterium mediated penetration. It is proved by the experiment that the method of the invention can successfully realize the instant transformation of Chinese cabbage and has high conversion efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种白菜瞬时转化的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种白菜瞬时转化的方法。
技术介绍
将外源基因转入到植物体内，是研究基因功能的主要手段。植物遗传转化包括稳定转化和瞬时转化。利用农杆菌介导的稳定转化技术已经应用到很多作物物种中，是目前研究基因体内功能的常用方法。但是稳定转化技术的转化及再生效率低，并且耗时比较长，如果要对多个基因开展功能研究会耗费大量时间和精力。瞬时表达(transienentgeneexpression)是指将外源基因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物质在一定时间内实现转录和翻译并积累相应表达产物的技术。瞬时表达方法较稳定表达方法具有操作简单，周期短，反应植物体内工作环境，表达效率高，安全高效等诸多突出优点。近二十几年来，利用农杆菌介导的叶片注射渗透法(agroinfiltration)，进行基因瞬时表达，已经成为进行RNA，smallRNA的分析，蛋白定位，蛋白互作，泛素化系统以及抗体制备等方面研究的重要方法(Goodinetal.,2002；Koscianskaetal.,2005；Rodriguezetal.,2005；Liuetal.,2010)。农杆菌注射渗透法是将农杆菌菌液直接应用于不同物种植物体中，其中应用最广泛的是模式植物本氏烟草(Nicotianabenthamiana)的叶片。利用本氏烟草不只因为它是实验室中易种植的模式植物，还因为可以在烟草中利用基因沉默抑制子p19和P1/HC-Pro大幅提升烟草中蛋白表达水平(Kapilaetal.,1997；JohansenandCarrington,2001；Voinnetetal.,2003；Maetal.,2008)。在近二十几年的技术发展中，研究者已经将这种农杆菌注射介导的瞬时转化体系应用到许多物种中，包括拟南芥，番茄，莴笋的叶片中，还有苹果，梨，番茄，桃，草莓的果实细胞中(Choietal.,2004；Hoffmanetal.,2006；Santos-Rosaetal.,2008；Sohietal.,2005；Voinnetetal.,1999；Yangetal.,2000；Wroblewskietal.,2005；Spolaoreetal.,2001)，在植物抗病，启动子分析，外源蛋白的表达以及蛋白定位，蛋白之间互作关系等方面都有广泛的应用。在白菜中农杆菌介导的瞬时表达体系的应用尚未有报道。目前，白菜稳定遗传转化工作已有了初步进展，农杆菌介导的子叶柄侵染法以及白菜春化后对花柱的农杆菌真空渗透法(Lawrensonetal.,2015；HeYuke,2013)。但是，这两种方法的转化效率仍然非常低，整个转化的周期长达4-5个月，对于高通量的基因功能研究以及体内基因功能的初步筛选都是非常耗时耗力的。在白菜中，利用瞬时转化体系，可以进行白菜基因的细胞定位研究，蛋白互作研究，以及注射后叶片的抗病研究等。相比获得稳定的白菜转基因植株，瞬时表达体系能够快速高通量的鉴定及筛选基因功能。不仅为大规模的基因功能筛选提供可能，而且也使转基因植株的构建更有针对性。因此，建立白菜叶片的瞬时转化体系是高效进行白菜基因功能研究所必需的。然而，白菜叶片本身很难实现液体的注射渗透，利用常规叶片注射方法并不能顺利实现转化蛋白的瞬时表达。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何实现白菜的瞬时转化。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种白菜瞬时转化方法。本专利技术提供的白菜瞬时转化方法包括如下步骤：将目的基因导入农杆菌中，得到重组菌；用所述重组菌侵染白菜外植体，实现白菜的瞬时转化；所述目的基因通过重组载体导入农杆菌中；所述重组载体是将目的基因克隆至表达载体的多克隆位点得到的载体；所述重组载体中用于启动目的基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子；所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。本专利技术的甘露醇合成酶启动子中含有三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列，三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列如序列2第656-1112位所示。上述方法中，用所述重组菌侵染白菜外植体的方法包括如下步骤：将OD600为0.2的所述重组菌与OD600为0.1的p19菌液混匀，得到混合菌液；用所述混合菌液侵染白菜子叶。所述p19菌液为将p19质粒转化到农杆菌菌株GV3101中得到。上述方法中，所述OD600为0.2的所述重组菌与OD600为0.1的p19菌液等体积混匀。上述方法中，所述白菜外植体为白菜子叶。所述子叶为真叶刚长出时，即子叶长到最大时的子叶。上述方法中，所述表达载体为pCambia1300载体。上述方法中，所述重组载体为将pCambia1300载体的35S启动子替换为甘露醇合成酶启动子，且在pCambia1300载体的KpnⅠ和SacⅠ位点间连入GFP基因序列后得到的载体。上述方法中，所述农杆菌可为常用的农杆菌菌株，如EHA105或GV3101等。在本专利技术的具体实施例中，所述农杆菌为农杆菌菌株GV3101。上述方法中，所述侵染的方法为注射。具体注射方法可包括如下步骤：用1ml无针头的注射器将混合菌液注射到白菜子叶中，直至水渍充满整个叶片。上述方法中，所述侵染后还包括将所述白菜置于如下条件下进行培养的步骤：25℃条件下光照16小时，20℃条件下黑暗8小时，湿度50-60％。本专利技术的另一个目的是提供甘露醇合成酶启动子的新用途。所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。本专利技术提供了甘露醇合成酶启动子在白菜遗传转化中的应用。上述应用中，所述遗传转化为瞬时转化。上述方法或应用中，所述白菜可为大白菜；所述大白菜品种具体可为“秦二小”和“A8尖”。本专利技术在烟草农杆菌注射方法的基础之上，对注射部位，注射农杆菌浓度，注射载体等方面进行调整，建立了适用于白菜的农杆菌注射渗透介导的瞬时表达体系。通过实验证明：本专利技术的方法可成功实现白菜瞬时转化，且有较高的转化效率。附图说明图1为适宜条件下生长的白菜子叶。图1中上面两颗白菜中的箭头指向的为白菜“A8尖”的子叶，图1中下面两颗白菜中箭头指向为白菜“秦二小”的子叶。图2为白菜叶片注射表达GFP后绿色荧光检测情况。0.8/1.0，0.3/0.5，0.1/0.2分别代表了注射时p19/GV3101菌液与pCambiaSuper1300-GFP/GV3101菌液的OD600值。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的pMDC43载体记载于文献“AGatewayCloningVectorSetforHigh-ThroughputFunctionalAnalysisofGenesPlanta”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的p19质粒记载于文献“AnefficientsystemtodetectproteinubiquitinationbyagroinfiltrationinNicotianabenthamiana”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白菜瞬时转化方法，包括如下步骤：将目的基因导入农杆菌中，得到重组菌；用所述重组菌侵染白菜外植体，实现白菜的瞬时转化；所述目的基因通过重组载体导入农杆菌中；所述重组载体是将目的基因克隆至表达载体的多克隆位点得到的载体；所述重组载体中用于启动目的基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子；所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。

【技术特征摘要】
1.一种白菜瞬时转化方法，包括如下步骤：将目的基因导入农杆菌中，得到重组菌；用所述重组菌侵染白菜外植体，实现白菜的瞬时转化；所述目的基因通过重组载体导入农杆菌中；所述重组载体是将目的基因克隆至表达载体的多克隆位点得到的载体；所述重组载体中用于启动目的基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子；所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用所述重组菌侵染白菜外植体的方法包括如下步骤：将OD600为0.1的所述重组菌与OD600为0.2的p19菌液混匀，得到混合菌液；用所述混合菌液侵染白菜子叶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述OD600为0.1的所述重组菌与所述OD600为0.2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：于拴仓，张彬，苏同兵，张凤兰，李佩荣，李盼，余阳俊，张德双，赵岫云，汪维红，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11