壳聚糖酶分离纯化新工艺制造技术

本发明专利技术涉及壳聚糖酶分离纯化新工艺。将产壳聚糖酶真菌发酵液离心得粗酶液，向其中加入聚乙二醇（ＰＥＧ）使其终浓度低于１０％，２～８℃下静置２～４ｈ，离心，上清液－１０～－３０℃预冻一段时间后缓慢加入－１０～－３０℃的丙酮，混匀，使其终浓度达４０～７０％，－１０～－３０℃静置２～４ｈ，离心，收集沉淀得初步分离的壳聚糖酶。利用本工艺初步分离纯化壳聚糖酶，工艺简便，蛋白质不易失活，提纯效果好且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种壳聚糖酶分离纯化新工艺，具体而言就是用低浓度的聚乙二醇(PEG)先对产壳聚糖酶的真菌粗提液中壳聚糖酶进行保护，再用丙酮使其沉淀而分离提纯出来的方法。
技术介绍
几丁质是产量仅次于纤维素的第二大类多糖，壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物，是一种高分子阳离子絮凝剂。而壳聚糖的降解产物壳寡糖不仅具有水溶性好、易吸收等优点，近年来更是发现，低分子量壳寡聚糖(如五糖、六糖)具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，使其在医药领域有着广泛的应用前景。目前，由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种水解方法化学降解法(如酸解法)和酶解法。其中利用壳聚糖酶专一水解壳聚糖是一种较为理想的壳寡糖制备方法，该方法具有反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物等优点，从而为大规模生产提供了可能。目前，壳聚糖酶的生产主要是从产壳聚糖酶的真菌发酵液中来提取。在粗酶液的初步分离纯化中，目前文献报道的最常用工艺是用盐析法，主要是用硫酸铵。例如，《微生物学报》2001(1)，82～86报道唐亚雄等在产几丁质酶的产气肠杆菌的发酵液中加入固体硫酸铵至90％饱和度，4℃过夜后离心收集沉淀，酶的纯化倍数为1.07；《无锡轻工业大学学报》1999(2)，39～44报道杨瑞金等在产木聚糖酶的顶青酶初提液中加固体硫酸铵至20％饱和度后离心去除沉淀，再将体系的硫酸铵饱和度调节到80％，离心后酶的纯化倍数为2.2；《微生物学报》2002(4)，471～477报道路梅等分离纯化嗜热毛壳酶产生的内切β2葡聚糖酶，采用的是70％饱和度硫酸铵沉淀，纯化倍数为1.94；《菌物系统》2001(2)178～183报道李卫芬等对里氏木酶所产β-葡聚糖酶粗酶液用30％饱和度硫酸铵沉淀，离心后上清液再用60％饱和度硫酸铵沉淀，纯化倍数为1.58。实验室采用盐析方法进行粗分离蛋白质不易失活，但是操作体积较大，后处理麻烦，不能直接进行离子交换层析，需要先进行脱盐处理(如透析或小孔径分子筛层析)，不适宜工业生产。工业上一般采用有机溶剂(如丙酮、乙醇)沉淀，该法分辨率较高，沉淀速度快，能够起到浓缩蛋白质溶液的目的，且能够降低盐浓度。但是该法易使蛋白质失活，样品活力损失较大。目前还有一种粗沉淀蛋白质的方法是用PEG，PEG是一种非离子水溶性多聚体，作为蛋白质沉淀剂，PEG只在个别浓度下才使蛋白质稍有变性。由于PEG溶解时散热低，沉淀效能高以及形成沉淀的平衡时间短等特点，使得PEG在蛋白质的组分分离中成为一个有用的试剂。但是使用PEG沉淀蛋白质分辨率较低，不适合采用分级沉淀的方法来达到粗分离的目的，而且沉淀蛋白质所需浓度的溶液(如30％的PEG6000)表观粘度一般较大，给分离沉淀操作带来不便。
技术实现思路
综合考虑各种分离纯化工艺的利弊，本专利技术提出了一种先用低浓度PEG进行保护，再用丙酮进行沉淀来粗提壳聚糖酶的具体方法。该方法具有工艺简便、蛋白质不易失活、提纯效果好的优点，具有推广应用价值。本专利技术的壳聚糖酶分离纯化新工艺是向产壳聚糖酶的真菌发酵液中加入高浓度的PEG贮备液，使PEG终浓度低于10％，2～8℃静置2～4h后，离心，收集上清液，-10～-30℃下预冻一段时间。向其中缓慢加入-10～-30℃的丙酮使其终浓度为40～70％，混匀后于-10～-30℃下静置2～4h，离心，收集沉淀。本专利技术的壳聚糖酶初步分离纯化新工艺中，壳聚糖酶的纯化倍数高于2.5倍，超过文献报道的同类酶纯化工艺的最高水平。本研究向发酵液中加入PEG至终浓度低于10％，一方面可以沉淀部分杂蛋白，同时由于PEG的絮凝作用，来自真菌孢子和培养基等的难以除去的小颗粒都聚集在一起自然沉降下来；另一方面，PEG能够在丙酮沉淀过程中保护蛋白质，同时PEG能降低溶液的冰点，因而可以将蛋白质溶液放入-10～-30℃中预冻而不会结冰，在加入冷丙酮沉淀蛋白的过程中可以进一步降低沉淀时的温度，减小因为蛋白质变性带来的活性损失。由于PEG溶于丙酮，大多数PEG通过离心随上清液除去，余下留在沉淀中的少量PEG也可以通过离子交换层析除去。本专利技术采用低盐离子浓度缓冲液，粗分离中也未引入高盐浓度的溶液，因此沉淀蛋白质溶解后可以直接进行离子交换层析，而不需要脱盐。下面通过若干实例的具体实施方式，再对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。具体实施例方式实例1(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体。(2)取上清液100ml，加入高浓度PEG溶液使其终浓度达6％。4℃静置2h，4000rpm离心10min，收集上清液，-10℃预冻60min。(3)缓慢加入-10℃丙酮100ml，混匀后于-10℃下静置2h，4000rpm离心10min，收集沉淀。(4)沉淀4℃真空干燥后溶解于20ml缓冲液中，10000rpm冷冻离心10min，收集上清液。得壳聚糖酶比活力为17.84U/mg，收率为95.51％，纯化倍数为2.61。实例2(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体。(2)取上清液100ml，加入高浓度PEG溶液使其终浓度达5％。3℃静置3h，4000rpm离心10min，收集上清液，-20℃预冻30min。(3)缓慢加入-20℃丙酮100ml，混匀后于-20℃下静置4h，4000rpm离心10min，收集沉淀。(4)沉淀4℃真空干燥后溶解于20ml缓冲液中，10000rpm冷冻离心，收集上清液。得壳聚糖酶比活力为16.96U/mg，收率为93.38％，纯化倍数为2.59。实例3(1)球孢白僵菌发酵液离心除去菌丝体。(2)取上清液100ml，加入高浓度PEG溶液使其终浓度达7％。5℃静置4h，4000rpm离心10min，收集上清液，-30℃预冻40min。(3)缓慢加入-30℃丙酮100ml，混匀后于-30℃下静置4h，4000rpm离心10min，收集沉淀。(4)沉淀4℃真空干燥后溶解于20ml缓冲液中，10000rpm冷冻离心10min，收集上清液。得壳聚糖酶比活力为17.01u/mg，收率为94.19％，纯化倍数为2.55。壳聚糖酶活力测定采用PMAB法。用盐酸氨基葡萄糖(GlcN-HCl)溶液做标准曲线。一个酶活力单位定义为每分钟释放1μg GlcN-HClo还原糖所需要的酶量。权利要求1.壳聚糖酶分离纯化新工艺，用酶沉淀保护剂保护蛋白质后再用有机溶剂使其沉淀。其特征在于将产壳聚糖酶真菌发酵液离心得粗酶液，向其中加入聚乙二醇(PEG)，搅溶后一定温度下静置一段时间，离心，上清液一定温度下预冻一段时间后缓慢加入一定温度的丙酮，混匀，一定温度下静置一段时间，离心，收集沉淀得初步分离的壳聚糖酶。2.如权利要求1所述的壳聚糖酶分离纯化新工艺，其特征在于可用于产壳聚糖酶真菌发酵液或粗酶提取液中壳聚糖酶的初步分离纯化。3.如权利要求1所述的壳聚糖酶分离纯化新工艺，其特征在于先在粗酶液中加入PEG作为蛋白质保护剂，再用丙酮使壳聚糖酶沉淀。4.如权利要求1所述的壳聚糖酶分离纯化新工艺，其特征在于PEG浓度低于10％，丙酮浓度为40～70％。5.如权利要求1所述的壳聚糖酶分离纯化新工艺，其特征在于加入PEG后静置温度为2～8℃，静置时间为2～4h。6.本文档来自技高网...

【技术保护点】
壳聚糖酶分离纯化新工艺，用酶沉淀保护剂保护蛋白质后再用有机溶剂使其沉淀。其特征在于将产壳聚糖酶真菌发酵液离心得粗酶液，向其中加入聚乙二醇（ＰＥＧ），搅溶后一定温度下静置一段时间，离心，上清液一定温度下预冻一段时间后缓慢加入一定温度的丙酮，混匀，一定温度下静置一段时间，离心，收集沉淀得初步分离的壳聚糖酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余蓉，李晓红，张涛，杨俐，杨继虞，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]