重组水禽流感病毒 H7 亚型血凝素抗原、制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种重组水禽流感病毒Ｈ７亚型血凝素（ＨＡ）抗原、制备方法及其用途。本发明专利技术的重组水禽流感病毒Ｈ７亚型血凝素抗原，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国水禽流感病毒分离株的血凝素基因，利用表达的血凝素蛋白作为抗原可检测Ｈ７亚型流感病毒及感染产生的抗血凝素蛋白抗体。虽然Ａ型流感病毒亚型众多，但血凝素抗原是流感病毒分类和诊断基础，因此，基于重组水禽流感病毒血凝素蛋白抗原建立的诊断技术可以检测鸭、鹅等水禽流感病毒的感染。本发明专利技术所生产的重组膜蛋白不仅生产容易，操作简单而且纯度较高，具有良好的特异性和敏感性。且重组膜蛋白纯化后包被聚苯乙烯微量反应板也可建立敏感性更高的ＥＬＩＳＡ诊断方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及到一种重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原、制备方法及其用途。
技术介绍
禽流感(avian influenza)，全称禽类流行性感冒病毒感染，是由正粘病毒科、流感病毒属的A型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统感染到败血症等多种症状的传染病，禽类感染后病死率很高。1878年，Perroncito在意大利首次发现禽流感。1900年其病原体首次被人发现，1955年才经血清学证实属A(甲)型流感病毒。此后禽流感病毒一直在世界各地家禽中普遍存在，并造成了程度不同的影响。特别是1997年香港爆发的禽流感已经对人类健康构成威胁。至此，禽流感问题引起了世界各地的广泛关注。禽流感在全球广泛分布，其主要的储存宿主是水禽和迁徙的鸟类。由于A型流感病毒引起的禽流感，其病理变化因感染病毒毒株毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒株的毒力和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。鸡的流感病毒的抗体检测相继建立了鸡流感琼脂扩散(AGP)、血球凝集抑制试验(HI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学检测技术。然而，由于水禽的品种特殊性，其流感抗体的检测方法一直是困惑水禽疫苗免疫效果评估和水禽流感诊断的难题。因此，研制开发适用于水禽流感抗体检测的特异的、敏感的、生物安全度高的、适合于基层使用的诊断检测的器具，对水禽免疫水平进行实时监控和建立科学、灵活的水禽流感的免疫程序，以及对疫病的预防和控制有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原、制备方法及其用途。重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原水禽流感病毒H7亚型的核糖核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得血凝素基因，将该基因克隆于大肠杆菌原核表达载体并转化入宿主细胞后，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导表达并纯化获得血凝素蛋白抗原。所述的血凝素基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸开放读码框序列，并且编码具有SEQID No.2所示的多肽序列。重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原的制备方法的步骤如下1)水禽流感病毒H7亚型的核糖核酸为模板，以5’-CGAGATCTGACAAAATTTGCCTTGG-3’，5’-ACAAGCTTTTACCCTGTTGCCAGTAGT-3’引物，通过反转录聚合酶链式反应方法扩增获得血凝素基因；2)将血凝素基因插入到原核表达载体PET28a，获得含有血凝素基因的原核表达重组载体PET-血凝素；3)将该重组载体转化宿主细胞BL21，并用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导；4)诱导表达的蛋白经Ni-NTA Argarose纯化系统可得到纯的H7血凝素蛋白抗原。重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原在诊断中的用途利用原核表达的血凝素蛋白作为抗原检测H7亚型流感病毒感染产生的抗血凝素蛋白抗体，诊断水禽流感病毒及免疫动物的抗体水平。本专利技术具有如下积极效果1.基于重组的水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原的诊断技术的建立为在我国对水禽流感的流行病学调查及诊断提供了重要的技术基础；2.所生产的重组膜蛋白不仅生产容易，操作简单而且纯度较高，具有良好的特异性和敏感性；3.将重组膜蛋白纯化后包被聚苯乙烯微量反应板也可建立敏感性更高的ELISA诊断方法；4.建立了简单、方便、快速易于推广的水禽流感诊断方法，解决了一直困惑于我国的关于水禽流感的诊断问题。制作过程简单，而且成本低，便于推广使用；5.由于血凝素/HI技术除需要一定的技术条件外也容易产生非特异性的结果。而在原核表达系统中表达的膜蛋白不仅表达量高而且具有生物反应活性，是近来用于生产诊断性抗原的一种新型方法，利用表达产物的生物活性可直接检测病毒的感染，而且所表达的膜蛋白融合了组氨酸标签，这同时也使蛋白质的纯化易于操作。为建立更为敏感的酶联免疫吸附试验诊断方法提供了技术支持；6.高致病性禽流感是世界各国重点检疫和防范的疫病，危害巨大，除直接影响养禽业的发展，给家禽养殖业造成沉重打击外，还影响禽类产品的安全和影响国内、国际贸易。而且，还具有重要的公共卫生意义，向人类健康提出了新的严峻挑战。野生水禽尤其是鸭、鹅，被公认为是禽流感病毒的储存宿主和传染源，因此为了研究和控制禽流感的广泛流行，必须对野生水禽免疫水平进行实时监控并建立科学、灵活的水禽流感的免疫程序，为控制其流行达到预防目的。本产品为防治工作开创了新的途径；7.水禽流感病毒H7亚型血凝素抗体间接酶联免疫吸附试验诊断技术的建立为我国对该病的流行进行调查及及时准确的诊断和防治本病提供了技术基础。以水禽流感病毒H7亚型血凝素蛋白为基础可以进行多方面的开发应用，例如a.以重组蛋白为基础的ELISA诊断技术可实现对野生水禽及家禽的H7亚型禽流感感染的鉴别诊断；b.以重组膜蛋白为基础可进行血凝素蛋白的纯化，进而可用于研究血凝素蛋白的功能结构等；以重组膜蛋白为基础可进行血凝素蛋白的纯化，进而建立更敏感的Dot-ELISA，免疫荧光和免疫印迹等诊断方法。附图说明附图是重组AIV/H7血凝素蛋白的抗原活性鉴定结果，图中A为重组蛋白的聚丙稀酰胺凝胶电泳分析，B为重组蛋白的免疫印迹试验鉴定，M.为蛋白质Marker，1为大肠杆菌BL21(DE3)菌体蛋白，2为重组质粒未诱导菌体蛋白，3为重组质粒诱导4h表达产物，4为纯化的重组H7/血凝素融合蛋白，5为表达产物H7/血凝素蛋白的免疫印迹具体实施方式重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原是诊断水禽流感病毒H7亚型感染的重组膜蛋白，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国H7亚型水禽流感病毒分离株(H7N1亚型)血凝素基因，利用原核表达的血凝素蛋白作为抗原检测水禽流感病毒H7亚型感染产生的抗血凝素蛋白抗体。重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原的表达方法是利用反转录聚合酶链式反应方法克隆了分离于H7亚型水禽流感病毒的血凝素基因，然后将血凝素基因用限制性内切酶消化下来再与相同处理的原核表达载体PET28a进行连接，获得含有血凝素基因的表达质粒PET-血凝素(PETHA)；用PETHA转化受体菌BL21(DE3)，挑取单个菌落，用诱导剂以不同浓度进行诱导驯化，并在不同时间收集样品。经聚丙稀酰胺凝胶电泳分析证实血凝素的表达并确定异丙基-b-d-硫代半乳糖苷的最佳诱导浓度及诱导时间分别为1毫摩尔和4小时。用聚丙稀酰胺凝胶电泳后的蛋白带进行转膜，免疫印迹试验证实了所表达的重组膜蛋白大小相符，并具有反应活性。通过特异性、敏感性及工作条件的选择性实验，建立了水禽流感病毒H7亚型血凝素抗体间接酶联免疫吸附试验检测技术。重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原在诊断中可应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)，琼扩诊断技术(AGIP)，免疫印迹试验(Western Blot)，也可用于检测H7亚型流感病毒感染，包括H7亚型鸭流感病毒，H7亚型鹅流感病毒等其它水禽流感病毒。实施例1重组水禽流感病毒H7亚型血凝素抗原的表达和制备方法一、H7N1亚型AIV的培养及RNA的提取取H7N1种毒经尿囊腔接种于9-11日龄SPF鸡胚，35℃温箱孵育，收集24h后死亡鸡胚尿囊液，采用差速离心法纯化病毒，用TEN缓冲液重悬病毒，RNA提取按Trizol试剂盒说明书本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组水禽流感病毒Ｈ７亚型血凝素抗原，其特征在于：水禽流感病毒Ｈ７亚型的核糖核酸为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得血凝素基因，将该基因克隆于大肠杆菌原核表达载体并转化入宿主细胞后，用异丙基－ｂ－ｄ－硫代半乳糖苷诱导表达并纯化获得血凝素蛋白抗原。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，吴建祥，陈洪勋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]