一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法技术

一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，通过满江红植物修复长期施用畜禽粪肥以及污水灌溉的土壤，增加了土壤微生物多样性，促进了土壤中抗生素的降解，减少了土壤中有效态重金属含量。在适宜剂量满江红植物修复条件下，土壤中抗生素与有效态重金属的含量分别下降28.1％‑44.8％和46.8％‑95.9％，且抗性基因的数量减少27.1％。满江红植物修复技术能有效控制土壤中的总抗性基因、转座酶基因的相对丰度。满江红植物修复技术是一种能够有效治理土壤中重金属、抗生素与抗性基因复合污染的绿色技术方法。该方法操作简单、实施方便、成本低、绿色环保等优点，具有广阔的应用前景。

A method for remediation of resistant gene pollution in soil

A method of resistance gene in soil pollution remediation, phytoremediation by Azolla long-term application of livestock manure and sewage irrigation soil, increase soil microbial diversity, promote the degradation of antibiotics in soil, reducing the available content of heavy metals in soil. The appropriate dosage of Azolla in phytoremediation conditions, the content of antibiotics and heavy metals in soil decreased by 28.1% 44.8% and 46.8% 95.9% respectively, and the number of resistance genes decreased by 27.1%. Azolla phytoremediation technology can effectively control the relative abundance of total soil resistance gene, transposase gene. Azolla phytoremediation is an effective treatment of heavy metals in soil, and the antibiotic resistance genes of complex pollution green technology. This method has the advantages of simple operation, convenient implementation, low cost, green environmental protection and so on, and has a broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法
本专利技术具体涉及土壤修复
，具体涉及一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法。
技术介绍
滥用抗生素而诱发耐药性致病菌已引起人们对抗生素及抗性基因(ARGs)扩散的关注。ARGs的持久性残留，以及在不同环境介质中的传播比抗生素本身的环境危害更大。含抗生素灌溉水会造成土壤污染，与施用含抗生素的粪肥一样为土壤抗生素的重要来源。畜禽粪便中含有高水平的抗生素、重金属(与抗性基因之间有协同选择作用)、抗性微生物和抗性基因，其资源化利用过程中对环境的影响是目前受关注的问题。土壤是畜禽粪便消纳的主要场所，是人类病原菌抗性基因的主要来源。施用猪粪是影响土壤中抗性基因丰度的重要因素，会显著增加土壤微生物对抗生素的抗性水平。堆肥发酵能降低新鲜畜禽粪肥中残留抗生素的浓度，并降低其抗性基因含量，目前已有一些通过调控堆肥达到控制抗性基因传播的技术模式。畜禽粪肥的大量施用，极有可能会造成土壤的抗性基因污染。植物修复技术是一种低成本的高效绿色环保技术，而如何利用该技术来治理土壤的抗性基因污染，迄今尚未解决。满江红是真蕨纲满江红科浮水植物，在我国广泛分布，为一年生草本，四季繁茂，分蘖能力强，植株矮小，根丛生，植株氮积累明显、有机质含量高，净水效果好。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，促进了土壤中抗生素的降解，减少了土壤中有效态重金属含量以及抗性基因的数量减少。本专利技术采用的技术解决方案是：一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，所述的修复方法为，通过在树木根系周围填埋鲜满江红植物，所述的满江红植物填埋的量为每棵树木根系周围填埋5-15kg满江红植物。所述的填埋鲜满江红植物的深度为5-10cm。所述的在树木根系周围填埋鲜满江红植物的方式为：在树木根系一周均匀放置满江红植物并掩埋。所述的树木根系周围区域为以树为中心的面积为1.4m×1.4m的区域。所述的树木为瓯柑树。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，通过满江红植物修复长期施用畜禽粪肥以及污水灌溉的土壤，增加了土壤微生物多样性，促进了土壤中抗生素的降解，减少了土壤中有效态重金属含量。在适宜剂量满江红植物修复条件下，土壤中抗生素与有效态重金属的含量分别下降28.1％-44.8％和46.8％-95.9％，且抗性基因的数量减少27.1％。满江红植物修复技术能有效控制土壤中的总抗性基因、转座酶基因的相对丰度。满江红植物修复技术是一种能够有效治理土壤中重金属、抗生素与抗性基因复合污染的绿色技术方法，该方法操作简单、实施方便、成本低、绿色环保等优点，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，实施例仅是本专利技术的优选实施方式，不是对本专利技术的限定。方法采样区概况采样点位于温州市瓯海区的三垟瓯柑园。瓯柑是地方特色水果，三垟瓯柑园面积约1000亩，柑园中贯穿大量小河沟，柑园面源污染排放导致河水严重污染。种植户直接利用河水回灌柑园，且长期施用畜禽粪肥。在柑园中沿河沟围网养殖满江红植物，利用植物-微生物联合处理河水，并打捞满江红用于修复柑园土壤。采样点设置与样品采集2016年4月，在三垟瓯柑园选定18棵大小一致的瓯柑树。在每棵瓯柑树冠下以瓯柑树为中心设置相同面积(1.4m×1.4m)样地。在样地中10cm深处均匀填埋不同鲜重(5kg、7.5kg、10kg、12.5kg、15kg)的满江红植物，每一填埋量均重复设置3块样地，共18块，其中3个未填埋满江红的样地，做为对照。45d后，在每个样地内15cm深处按“S”形线路五点法采取土壤，混匀装入无菌样品袋中。按照由低到高的植物填埋量次序，将土样标为AS1、AS2、AS3、AS4、AS5，对照样品标为CS。采集的土壤去除植物根与可见有机物残体。每个采样均由5个小样组成，并现场均匀混合。将样品装入冰盒带回实验室分析。200g鲜样风干过筛后进行理化指标检测；另200g样品过2mm筛后进行真空冷冻干燥储存在-80℃，以备总基因组DNA提取，用于微生物和抗性基因分析；剩余样品保存于-80℃以备重金属及抗生素检测。土壤理化性质测定土壤基本理化性质按照土壤农化常规方法测定。样品抗生素测定土样于室内风干粉碎过60目筛备测。样品预处理方法参考相关文献并进行改进：称取1.00g土样置于10mL离心管中，加入50％硝酸镁-氨水溶液(96/4，体积比)4mL，振荡5min，超声提取15min，离心(4500r·min-1)8min，收集上清液。残渣再用上述方法反复提取2次。合并上清液，再过HLB固相萃取小柱(先后过6mL甲醇和6mL水)萃取富集。用6mL水清洗小柱，真空干燥10min，再用3mL1％乙酸-乙腈洗脱小柱。洗脱液在40℃水浴下用氮气吹至近干，用乙腈-水(20/80，体积比)定容至1mL，溶液过0.22μm滤膜收集于样品瓶中，在4℃下保存供LC-MS/MS分析测定。样品重金属测定土样经过前处理、风干、磨细过100目尼龙筛后待用。土样重金属(Pb、Zn、Cu、Cd)的形态(可交换态、可还原态、可氧化态、残渣态)分析采用欧共体参考物质署提出的三步连续分级提取法。分析过程中添加国家标准物质进行质量控制。样品处理后Pb、Zn、Cu和Cd采用原子吸收光谱仪测定。样品的微生物群落结构从真空冷冻干燥的3个重复土样中各取等量样品，混匀，再从中取样品0.1g，采用DNA提取试剂盒PowerDNAIsolationKit提取样品中微生物总DNA。采用基于IlluminaHiSeq2000的高通量测序技术分析样品的微生物群落结构。研究目标片段为细菌16SrDNA的V6高变区，PCR扩增采用引物F985(5’-CNACGCGAAGAACCTTANC-3’)/R1046(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)，扩增程序及条件参考相关文献。测得的序列通过拼接及筛选后，以相似性97％为标准获得操作分类单元(OTU)，OTU通过RDP数据库(http：//rdp.cme.msu.edu/)中Classifer程序进行检索分类，分析微生物群落Shannon多样性指数、种类组成、相对丰度，对比各样品的微生物群落结构。抗性基因的高通量荧光定量分析从真空冷冻干燥的3个重复土样中各取等量样品，混匀，再从中称取土样0.5g，采用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取土样总DNA，随后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳验证。所提取的DNA样品用微量核酸蛋白质分析仪测定浓度以及相应纯度，所提取DNA样品的A260/A280值在1.8～2.0之间。采用SmartChipReal-timePCRSystems高通量荧光定量的反应平台。荧光定量试剂是LightCycler480SYBRGreenIMaster。定量体系体积100nL，其中各试剂终浓度为：LightCycler480SYBRGreenIMasterMix1×，Nuclease-freePCR-Gradewater，BSA1μg·μL-1，DNA浓度5ng·μL-1，引物1μmol·L-1。定量PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火延伸30s，40个循环；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，其特征在于，所述的修复方法为，通过在树木根系周围填埋鲜满江红植物，所述的满江红植物填埋的量为每棵树木根系周围填埋5‑15kg满江红植物。

【技术特征摘要】
1.一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，其特征在于，所述的修复方法为，通过在树木根系周围填埋鲜满江红植物，所述的满江红植物填埋的量为每棵树木根系周围填埋5-15kg满江红植物。2.根据权利要求1所述的一种修复治理土壤中抗性基因污染的方法，其特征在于，所述的填埋鲜满江红植物的深度为5-10cm。3.根据权利要求1所述的一种修复治理土壤中抗性基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓明，张辉，
申请(专利权)人：温州科技职业学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33