人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法技术

本发明专利技术公开了人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法。本发明专利技术采用真核分泌表达的方法来制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，包括：（１）具有工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成以及表达载体的构建；（２）工程菌的构建及发酵；（３）重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备与纯化。本发明专利技术采用基因工程技术制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，克服了从人体组织中提取，成本高且来源少等缺点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程
，涉及一种人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法。
技术介绍
胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于哺乳动物的消化系统。胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一种由胰腺腺泡细胞合成，并和各种淀粉酶，脂肪酶，蛋白水解酶等一起分泌到胆汁。胰腺分泌的蛋白水解酶有很大一部分是内源性蛋白水解酶，包括胰蛋白酶，糜蛋白酶，弹性蛋白酶等。这些蛋白水解酶可以水解蛋白之间的肽键，也会导致胰腺自身的损伤。体内有几种方式确保蛋白水解酶在一定的情况下以失活的状态存在以免造成自体损伤以蛋白酶原形式存在于胰腺的导管当中；以酶原颗粒的方式包装起来；分泌蛋白酶抑制剂抑制小部分被激活的蛋白酶原。胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一多功能抑制剂，能够有效抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纤维蛋白酶及各种组织或血浆激肽释放酶等多种蛋白水解酶的活性，减少溶酶体酶释放，改善循环状况和组织灌注，抑制炎症介质产生和释放。人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂在治疗急性胰腺炎，烧伤后的休克及产后大出血等疾病，有独特的疗效；是治疗上述疾病最适合的胰蛋白酶抑制剂药物人源性蛋白，不会产生免疫原反应被机体的免疫系统清除，可延长药物的效应；作为一种小分子蛋白(分子量只有6.2KD)，能通过肾小球滤过膜，因此可高效抑制释放到外周体液的蛋白水解酶。天然的人源性胰蛋白酶抑制剂需要从人的胆汁中分离提取，纯化步骤繁琐，材料来源极少，难以大量获取。基因重组技术可以提供一个大量获得重组人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的方法。通过基因重组技术获得的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，具有和天然人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂相同的氨基酸序列和二级结构，相当的抑制胰蛋白酶的活性，可具同样的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术采用基因工程技术制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，以克服从人体组织中提取，成本高且来源少等缺点。本专利技术采用真核分泌表达的方法来制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，包括(1)具有工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成以及表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备与纯化。本专利技术的目的可以通过以下措施来达到(1)具有毕赤酵母工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂全基因序列的合成以及表达载体的构建的具体方法如下按毕赤酵母密码子偏好性化学合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因，其核苷酸序列为5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAACGGTTGTACCAAAATTTATGATCCAGTTTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAGACCTCTATTCTGATTCAGAAATCTGGTCCATGT-3’(2)设计引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因为模板，进行PCR扩增；(3)将所获得的编码人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因克隆在质粒中，进行DNA序列测序分析与所设计的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因序列完全相符；(4)经序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆到商业化表达载体pPIC9K，转化甲醇酵母菌株KM71；(5)对甲醇酵母菌株KM71进行甲醇诱导表达。上清中的表达产物经过层析柱等分离纯化，最终获得具有人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂生物活性的重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂产物。该重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂具有生物活性，该重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂能够有效抑制胰蛋白酶的活性。本专利技术的优点1.对人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂在真核细胞甲醇酵母中进行分泌表达，简化后继的纯化步骤。2.采用离子交换层析和分子筛层析方法进行纯化人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，比其他所报道的亲和层析更简单，成本更低。3.经高密度发酵表达后可获得高达0.9g/L的高表达量，比以往报道的重组表达人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的表达量高18倍。附图说明图1为人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的PCR电泳结果。M100bp DNAmarker；1，2阴性对照；3，4PCR目的条带。图2为含人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的pPIC9K-rHuPSTI表达质粒酶切鉴定图。1100bp DNA marker；2pPIC9K-rHuPSTI Xho I/Not I双酶切。图3为pPIC9K-rHuPSTI表达质粒酶切线性化电泳图。1wide range marker；2线性化后的pPIC9K-rHuPSTI表达质粒；3环状的pPIC9K-rHuPSTI质粒。图4是重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂发酵上清表达产物SDS-PAGE分析图谱。1发酵上清；2G25分子筛穿过峰；3QXL阴离子层析柱穿过峰；4QXL阴离子层析柱洗脱峰；5分子筛分离的目的蛋白。图5为含基因rHuPSTI的重组表达质粒pPIC9K-rHuPSTI构建图。具体实施例方式现结合实施例对本专利技术重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备作详细描述实施例1重组表达质粒pPIC9K-rHuPSTI的构建1.试剂与材料载体质粒pPICZαA和pPIC9K购自Invitrogen公司；表达菌株KM71购自Invitrogen公司，重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因由上海博亚生物技术公司合成；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England公司，PCR引物由上海博亚生物技术公司合成，胶回收试剂盒购自Omega生物技术公司。2.方法(1)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成I.引物合成由于该基因核苷酸序列较长，直接合成目的基因较难，因此经过从技术上以及经济上的考虑后，通过合成四段引物经过PCR的方法扩增出全长的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因。1.5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAA-3’2.5’-TGTTACCATCGGTACCACAAACTGGATCATAAATTTTGGTACAACCGTTCAGTTCGTTATAACATTT-3’3.5’-TTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAG-3’4.5’-ACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAATAGAGGTCTGACGTTTACGGTTTTCAA-3’II.PCR扩增取上述四段引物各50pmol混合于同一管PCR反应体系中，再分别加入5ul 10×的PCR缓冲液，4ul 2.5mM dNTP以及0.25U Taq酶，并用H2O定容到50ul。通过PCR扩增获得改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因。PCR扩增的条件为 PCR扩增，电泳检测，发现在200bp附近出现预期的特异性扩增带(见图1)，回收此带，获得改造所得的改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因全长。(2)寡核苷酸引物上游引物5’-AAACTAGAGAAAGAGAGGCTGAAGCTGATTCTCTGGGTCGTGAAGC-3’下游引物5’-TTTGCGGCCGCTTAACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAA-3’上游引物内含Xho I酶切位点(单下划线)、pPICZαA载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，包括以下步骤：（１）按毕赤酵母密码子偏好性化学合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因，其核苷酸序列为：５’－ＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＡＣＧＡ ＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＴＣＴＧ ＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴ－３’；（２）设计引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因为模板，进行ＰＣＲ扩增；（３）将所获得的编码人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因克隆在质粒中，进行ＤＮＡ序列测序分析与所设 计的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因序列完全相符；（４）经序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆到商业化表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ，转化甲醇酵母菌株ＫＭ７１；（５）对甲醇酵母菌株ＫＭ７１进行甲醇诱导表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，任宇锋，赖春娥，区景行，王磊，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]