纯化病毒的方法技术

本发明专利技术描述了用于由细胞裂解物制剂纯化病毒的方法，其优选由两个连续层析步骤组成；第一个是澄清步骤，其中利用大小排阻层析，而第二个是病毒捕获和释放步骤，其中使用阴离子交换层析，所述连续层析步骤具有纯化病毒且避免层析缓冲液电导率调整的优势。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文描述的专利技术属于病毒纯化领域。
技术介绍
现已重新兴起使用病毒来治疗癌症(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。研究最多的病毒可能是腺病毒，而且最近的大部分工作是由McCormick及其同事完成的。他们使用的腺病毒具有E1B基因缺失，该基因编码的55kd蛋白质可结合肿瘤抑制基因p53并抑制其功能(Science，1996；vol.274page 373)。病毒以缺乏p53功能的肿瘤为目标，而且已经进入人体临床试验。经过遗传工程改造用于治疗癌症的另一种病毒是单纯疱疹病毒。已经构建并测试了不同突变体，包括在ICP34.5和ICP6基因中有突变的突变体。前者编码所谓的神经毒力因子，而后者编码核糖核苷酸还原酶的大亚基。ICP34.5突变病毒目前正在进行成胶质细胞瘤患者的I期人体临床试验(Market J，et al.，Gene Ther，vol.2000；vol.7page 867)。除了腺病毒和单纯疱疹病毒这两种研究最多的溶瘤病毒以外，已经、而且还将继续对具有溶瘤潜力的其它病毒进行大量工作，包括痘苗病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。由于再次兴起了将病毒作为溶瘤剂或作为投递疫苗或基因的手段，在实验室研究规模培养和显然不适于若病毒用于治疗大量患者而会需要的大规模生产。研究水平的病毒纯化一般使用基于密度的超速离心法进行。虽然该方法已经证明作为研究手段使用是有效的，但是它太昂贵、费时且不易放大用于工业规模的生产。可能替代超速离心的方法是层析。单独的大小排阻层析或与密度梯度离心相联合已经用于纯化某些植物病毒(Albrechtsen et al.，J Virological Methods 28245-256，1990)以及牛乳头瘤病毒(Hjorth andMereno-Lopez，JVirological Methods 5151-158(1982))和蜱传脑炎病毒(Crookset al.，J Chrom 50259-68(1990))。它还已用于生产重组逆转录病毒(Mento，S.J.，Viagene，Inc.，1994 WilliamsburgBioprocessing Conference)。Haruna等人(Virology 13264-267(1961))报导了使用DEAE阴离子交换层析来纯化1、3和8型腺病毒，而Klemperer和Pereir(Virology 9536-545(1959))与Philipson(Virology 10459-465(1960))报导了使用相同方法来纯化其它类型的腺病毒。另外，BlancheF.等人(Gene Ther 2000 Jun；7(12)1055-62)描述了用于检测和纯化腺病毒颗粒的改进型阴离子交换HPLC法。除了大小排阻和阴离子交换层析以外，还使用了其它层析方法来纯化病毒。例如，已报导了使用单克隆抗体(单抗)的亲和层析是纯化大豆花叶病毒的有效方法(Diaco et al.，J.Gen.Virol.67345-351.1986)。Fowler(J Virological Methods 1159-74.(1985))使用单抗亲和层析与密度梯度离心相偶联来纯化埃巴二氏病毒。O′Keeffe R.等人(Biotechnol Bioeng 1999 Mar 5；62(5)537-45)描述了使用cellufine-硫酸盐和肝素-HP基质对传染性单纯疱疹病毒疫苗的亲和吸附回收。Huyghe等人(Human Gene Therapy 61403-1416(1995))揭示了用于纯化重组腺病毒的几种方法的比较，这些方法包括阴离子交换层析、大小排阻层析、固定化锌亲和层析、超速离心，其结论是用于纯化重组腺病毒的优选方法是用核酸酶处理细胞裂解物，随后使用膜滤器过滤，接着进行DEAE层析，然后进行锌亲和层析。美国专利号4,724,210描述了用于纯化流感病毒的方法。美国专利号4,725,546描述了用于纯化日本脑炎病毒的方法。美国专利号4,725,547描述了用于纯化狂犬病病毒的方法。美国专利号4,855,055描述了通过化学亲和层析对含preS2的乙肝病毒表面抗原进行分离和纯化。美国专利号5,602,023描述了用于制备纯化的病毒疫苗的方法，包括通过蔗糖梯度超速离心、再水化和冻干来纯化病毒的步骤。美国专利号5,837,520要求保护用于纯化腺病毒的方法，该方法包括用选择性降解未包裹DNA和RNA二者的酶剂处理含有病毒颗粒的细胞裂解物、将经处理裂解物在第一种树脂上进行层析、并将第一种树脂的洗脱物在第二种树脂上进行层析，其中一种树脂是阴离子交换树脂而另一种是固定化金属离子亲和树脂。美国专利号6,008,036描述了通过层析用于，其中使用阴离子交换层析步骤，随后进行阳离子交换层析步骤，以及任选地金属结合型亲和层析步骤。美国专利号6,194,191描述了用于生产纯化的腺病毒组合物的方法，包括在培养基中培养宿主细胞通过灌注或经由分批补料方法为所述宿主细胞提供养分，用腺病毒感染所述宿主细胞，裂解所述宿主细胞以提供包含腺病毒的细胞裂解物，其中所述裂解是通过受感染细胞的自我裂解而实现的，并由所述裂解物纯化腺病毒以提供纯化的腺病毒组合物。还要求保护多种层析步骤，包括使用阴离子交换层析。美国专利号6,261,823中要求保护由病毒制剂纯化腺病毒的方法，包括将病毒制剂进行阴离子交换层析、由阴离子交换层析介质洗脱腺病毒、并将阴离子交换洗出液进行大小排阻层析的连续步骤，其中由大小排阻层析介质洗脱腺病毒。美国专利号6,383,795要求保护富集腺病毒溶液的方法，该方法使用含有选自下组的结合模块的阴离子交换层析树脂以使得腺病毒结合该层析树脂二甲基氨基丙基、二甲基氨基丁基、二甲基氨基异丁基、和二甲基氨基戊基。然后由树脂洗脱腺病毒。美国专利号6,537,793描述了纯化腺病毒的方法，包括使生物学培养基接触含有交联琼脂糖基质和通过柔性臂与交联琼脂糖基质结合的离子交换基团的支持物，以使得生物学培养基与层析支持物之间的接触将病毒颗粒与生物学培养基分开。值得注意的是，用于的主要特征常常包括阴离子交换层析及随后的大小排阻层析。最常见的是，在阴离子交换层析之前进行过滤步骤。就纯化的溶瘤病毒或在基因疗法中可用作病毒载体的病毒日益增长的需求而言，非常需要有改进的纯化方法。专利技术概述本专利技术的一个方面是使用大小排阻层析及随后的阴离子交换层析的连续步骤由含有病毒的制剂，所述连续层析步骤的优势在于澄清细胞裂解物制剂、纯化病毒、并避免层析缓冲液电导率的调整。本专利技术的另一个方面是使用大小排阻层析和阴离子交换层析的连续步骤由细胞裂解物制剂，其中大小排阻层析包括使用一种或多种不同的多孔层析材料。本专利技术的另一个方面是通过在大小排阻层析前用去污剂溶解细胞裂解物而由含有病毒的细胞裂解物制剂。本专利技术的另一个方面是通过在大小排阻层析前用去污剂和核酸酶溶解细胞裂解物而由含有病毒的细胞裂解物制剂。本专利技术的特色是在使用大小排阻层析及随后的阴离子交换层析由细胞裂解物制剂纯化病本文档来自技高网...

【技术保护点】
由含有所述病毒的制剂纯化所述病毒的方法，包括下列连续层析步骤：ａ）将病毒制剂进行大小排阻层析，并由所述大小排阻层析仪洗脱病毒；和ｂ）将步骤ａ的洗脱物进行阴离子交换层析，并由所述阴离子交换层析仪洗脱病毒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P克斯特尔，K亚纳吉马奇，C奥尔森，
申请(专利权)人：昂尼克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：US[]