本发明专利技术涉及棉花中金属硫蛋白蛋白ＧｈＭＴ１基因的克隆、重组及耐盐性功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。通过构建棉花盐胁迫ｃＤＮＡ文库和对照ｃＤＮＡ文库，再进行差异筛选，获得一系列表达有显著差异的ｃＤＮＡ序列，其中有一条为棉花金属硫蛋白基因，将其命名为ＧｈＭＴ１。进一步利用该基因转化烟草，获得的转基因植株能在２００ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］的盐浓度下较好生长。利用该基因转化水稻，获得该基因转基因植株能在１００ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］的盐浓度下较好生长。因此，该基因是一个抗盐基因，可以用于转化盐敏感植物来提高其耐盐能力，对于盐敏感植物在盐碱地上的推广种植，具有重要的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及棉花中金属硫蛋白基因GhMT1的克隆、重组及耐盐性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物
技术介绍
高浓度的盐引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢特别是降低农作物产量。严重的盐胁迫或渗透胁迫会引起植物体内的第二胁迫——氧化胁迫的发生，甚至导致植物死亡。因此，盐胁迫受到人们的广泛关注，提高作物的耐盐性亦愈来愈受到人们的重视。通过转基因提高作物的耐盐能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。本专利技术人通过构建棉花盐胁迫cDNA文库，利用差异筛选法获得了立一条棉花的金属硫蛋白基因GhMT1。进一步构建正义表达载体，转化烟草和水稻，转基因植株具有较高的耐盐性，烟草耐盐性可达200mM，水稻耐盐性可达100mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
技术实现思路
本专利技术从棉花中分离出编码某一金属硫蛋白(GhMT1)的全长cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。从300mM NaCl处理的棉花幼苗和正常生长的棉花幼苗叶片中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA，构建棉花盐胁迫cDNA文库和正常棉花cDNA文库。使用反相Northern差异筛选法，获得一条全长的cDNA为487bp，包括三端多聚A尾巴。开放阅读框部分为192bp，由此推得具63个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的水稻、大麦、草莓、葡萄的金属硫蛋白的氨基酸同源性71.4％，表明经过上述筛选步骤得到了编码金属硫蛋白的基因。该基因序列如下序列表(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度414碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.11 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*长度63氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC61 GSH用SmaI和SalI从pTriplEx2载体切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105.转化烟草，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM、100mM、200mM和300mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能较好的生长，具较高的耐盐能力。转化水稻，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM、50mM、100mM和150mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能较好的生长，具较高的耐盐能力。根据上述技术，从棉花中分离出编码金属硫蛋白的基因GhMT1，该基因过量表达能导致转基因烟草以及水稻具较高的耐盐性。让该基因在棉花中表达，将会提高棉花的耐盐性；如果与特异启动子连接，对其表达进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益。附图说明图1是野生型和转GhMT1基因烟草植株的盐处理后拍摄的图片横排表示NaCl浓度梯度，1代表野生型，2代表转基因植株。图2是野生型和转GhMT1基因水稻植株的叶绿素含量的测定结果柱状图横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示叶绿素含量1代表野生型，2代表转基因植株。图3是野生型和转GhMT1基因水稻植株的鲜重的测定结果柱状图横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示植株鲜重；1代表野生型，2代表转基因植株。(五)具体专利技术实施方式实施例1棉花金属硫蛋白基因GhMT1的获得1.棉花幼苗的处理棉花支棉3号生长10天的幼苗。400mM NaCl处理18小时，收集子叶；2.总RNA的提取采用RNAeasy plant mini kit(promoga公司产品)提取总RNA。3.使用SMART cDNA Library Construction Kit构建棉花盐胁迫cDNA文库以及对照cDNA文库。4.使用反相Northern差异筛选法筛选有表达差异的cDNA片断。5.将携带有表达差异的cDNA片断的pTriplEx2载体转入大肠杆菌BM25.8。6.序列测定本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得一条487bp的cDNA片断。7.同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较，确定它属于棉花金属硫蛋白基因。实施例2棉花金属硫蛋白基因GhMT1，如下序列(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度414碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源棉花(f)序列描述SEQ IN NO.11 atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga61 aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种权利要求一个克隆的棉花金属硫蛋白基因ＧｈＭＴ１，其特征在于它具有下述所示的核甘酸序列：１ａｔｇｇｃｔｇａｃａａｇｔｇｔｇｇｃａａｃｔｇｃｇａｔｔｇｃｇｃｔｇａｃａａｇａｇｃｃａｇｔｇｔｇｔｇａａｇａａａｇ ｇａ６１ａａｃａｇｃｔｔｇｇｔｃａｔｔｇａｇａｃｔｇａｇｇａｇａｇｃｔａｃａｔｃａｇｃａｃｃｇｔａｇｔｇｇｔｃｇａｇｃｃｔｃｔｇ１２１ｇｃａｇａｇａａｃｇａｔｇｇｃａａｇｔｇｃａａｇｔｇｃ ｇｇａａｃｔａｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｃａｃａａａｃｔｇｃａｃａｔｇｔ１８１ｇｇｃａｇｔｃａｃｔａａｇｃａｇａｃａｔａｔａｇａａｔｇａｔｇａａｇｔｔｔｇｇｇａｃｃｔａａａａａｇａａｔａａａａｇｔｔ ２４１ｇｇｇｔｔｇａａｔａａｔｔｔｇｔｇｔｃｔｔｔｔｇｔｔｇｔａｇｔｔｔｇａｇｔｇｔｇｔｔｔｔｃｔｔｇｔｃｔａｔｃｔｇｔｃｃｇ３０１ａｔｇａｔｔｇｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｃａｔｔｔｔａｔａｃａａ ｔｇａｔｇｇａａｔｇａｃｃａｔｇｔｃａａｔｇｇｃｃｔｔｔｇｔ３６１ｃｔｇａｔｔａａｔｇａａｃｔａｔｔａｔｔａｇｔａｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑成超，薛彤，李新征，朱玮，杨国栋，吴长艾，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]
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