用于虫害控制的表达系统技术方案

在昆虫中具有活性的启动子可以通过正反馈机制进行增强并与可抑制的致死效应相关联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含启动子的昆虫表达系统。通过重组DNA方法进行除了黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)之外的昆虫物种的遗传操作尚处于其初期(Alphey，2002；Alphey和Andreasen，2002；Alphey等，2002；Benedict和Robinson，2003；Berghammer等，1999；Catteruccia等，2000；Coates等，1998；Handler，2002；Horn等，2002；Jasinskiene等，1998；Lobo等，2002；Lozovsky等，2002；McCombs和Saul，1995；Moreira等，2004；Peloquin等，2000；Perera等，2002；Scott等，2004)，并且利用异源启动子只制成极少的非果蝇属(non-Drosophila)昆虫的转基因种系。昆虫转化是一种需要在大量非转化个体的背景中鉴定罕有转化子的低效系统。所以，转化子具有易于评分的标记是重要的。目前最受欢迎的是荧光蛋白，诸如GFP，DsRed及其突变体衍生物。对于它们的功能而言，这些需要转录控制元件，包括启动子。这些了解最清楚的是来自果蝇属(Drosophila)Actin5C(Act5C)和ubi-p63E(Pub)基因。还曾使用过Act5C，BmA3的蚕蛾同源物，以及一对组织特异性启动子(3×P3，合成的眼特异性启动子，和特异于间接飞行肌的Act88F)。不过，这些启动子没有完全令人满意的。Act5C曾被用来转化各种蚊子，以及果蝇属，但是其在蚊子中的表达模式远非遍在性的(Catteruccia等，2000；Pinkerton等，2000)。将它用作地中海实蝇(medfly)(Ceratitis capitata)中转化标记中的部分的尝试已经失败，而用Pub进行的相同试验则获得良好成功。Pub具有类似的限制地中海实蝇转化子中所见的表达模式是高度可变的，提示该表达模式至少对于位置效应是高度敏感的。此外，在根据需要进行开和关的意义上不能对这些启动子进行调控。Fussenegger等，(1998a；1998b)在一个实例中利用选择标记举例说明了正反馈驱动的多顺反子转录物。实验限于哺乳动物系统中。pTRIDENT被描述为一种三顺反子人工哺乳类操纵子。对于“代谢工程”描述了细胞周期阻滞基因(arresting gene)的表达或瞬时表达，即，所需蛋白质的调控性表达，并且提到由VP16反式激活蛋白结构域产生的转录“压制”效应可能对于宿主细胞是致死性的，即使是在中等表达水平上(Berger等，1990；Damke等，1995；Gill和Ptashne，1988；Gossen和Bujard，1992；Salghetti等，2001)。对自动调节性单或多顺反子系统的好处进行了讨论，包括一步，自动调节的和自动选择性多顺反子哺乳动物表达系统，其包括以多顺反子的，基于pTRIDENT的或quattrocistronic构型存在的tTA(pQuattro-tTA；Fussenegger等，(1998b)；图2)。由于tTA基因对多顺反子表达单位本身进行编码，所以少许或没有tTA在抑制性条件下得以表达。这种正反馈调控系统不显示压制信号。用转基因动物中的单顺反子正反馈构型进行的实验也不显示有害作用(Shockett等，1995)。已经对极少的启动子或其它控制元件进行过特征描述，并且对这些元件保持紧迫需要。希望提供在广泛的昆虫的全部或大多数细胞中具有活性的通用启动子，或者能够更加广泛地利用现有的启动子。另一个目标是调控昆虫启动子的活性，特别是以生命阶段和/或性别特异性的方式。选择性地减弱或消除特定细胞或组织中的启动子活性也是一个目标。本专利技术提供这些系统。令人吃惊的是，已经发现有可能采用正反馈机制来增强昆虫启动子的作用，以及控制其表达。因而，在第一方面，本专利技术提供一种包含至少一种待表达基因和至少一种其启动子的昆虫基因表达系统，其中待表达基因的产物对于所述至少一种启动子作为阳性转录控制因子而起作用，并且由此所述产物或产物的表达是可以控制的。本文所用的术语“基因”指可以转录或翻译成产物的任何DNA序列，至少一种具有体内的活性或功能。这种基因正常情况下将具有至少一种转录启动子以及与其可操作性关联的终止子。能够进行阳性转录控制的产物可以任何合适的方式作用。特别地，例如，所述产物可以结合位于启动子附近或启动子中的增强子，由此作用来增强在启动子上的聚合酶结合。可以采用其它机制，诸如阻遏物对抗机制，诸如转录或翻译的抑制剂的阻抑。例如，利用发夹RNA或核酶阻抑编码抑制剂的mRNA的翻译可以阻抑转录抑制剂，例如，或者所述产物可以直接结合所述抑制剂，由此避免转录或翻译的抑制。更加优选地，所述机制是正反馈机制，其中所述产物，其可以是RNA或其翻译产物，在转录增强子位点上作用，正常情况下是通过结合所述位点，由此增强启动子活性。启动子活性的增强随后作用来提高所述产物的基因的转录，所述产物接着进一步作用来提高抑制或增强促进，由此导致正反馈回路(loop)。所述产物的控制可以通过任何合适的方式进行，并且可以在任何水平上有效。特别地，优选的是所述控制有效阻抑所述控制因子基因的转录或阻抑其RNA产物的翻译，或防止或抑制所述基因的翻译产物的作用。例如，tTA(四环素可抑制性转录激活剂)的基因产物作用于tetO操纵基因序列(Baron和Bujard，2000；Gossen等，1994；Gossen和Bujard，1992)。在启动子的上游，在任一方向上，当被tTA基因的产物结合时，tetO能够提高来自与其紧邻的启动子的转录水平。如果tTA基因是包含tetO操纵基因以及启动子的表达盒的部分，那么当tTA基因产物被表达时发生正反馈。通过暴露于四环素轻易实现这种系统的控制，所述四环素结合基因产物并且防止tetO上的反式激活。tTA系统还具有在多种物种中提供阶段特异性毒性的优点。特别地，在许多昆虫的发育阶段观察到“压制”，易感昆虫的精确阶段是物种依赖性的。一些昆虫可以在幼虫死亡前到达蛹化，而其它的则在早期死亡。易感性从100％致死性到存活率小的降低。尽管如此，通常，成体昆虫好像对于tTA的压制作用具有免疫力，从而有可能在四环素存在的情况下饲养包含tTA正反馈系统的昆虫，并且随后将成体昆虫释放到野外。对于野生型来说这些昆虫具有少的或不具有竞争性缺点，并且将与野生型昆虫繁殖，但是携带tTA正反馈盒的幼虫将会在达到成熟前死亡。修饰tTA序列以增强与所需昆虫物种的相容性是相对简单的，并且这已在后附的实施例中用tTAV进行证明，所述tTAV具有额外的两个氨基酸以提供一个蛋白质酶位点，但它是由基本上改变自tTA序列的序列所编码的，以便更接近果蝇属的用法。因此，在一个优选的方面，如所述的那样本专利技术提供一种系统，其中至少一个基因是tTA，或是有效上调tetO启动子的编码与tTA相似产物的基因。因而，本专利技术与显性致死基因的组合使用，允许显性致死基因的选择性表达，或根据需要，允许致死基因或致死表型的阶段特异性表达。将会理解的是显性致死基因不必是正反馈机制的完整部分，但是例如，可以是双顺反子盒的部分。与RIDL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种昆虫基因表达系统，其包含至少一种待表达的基因和至少一个其启动子，其中待表达的基因的产物对于所述至少一个启动子作为阳性转录控制因子而起作用，并且由此所述产物或所述产物的表达是可以控制的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L阿尔菲，
申请(专利权)人：奥西泰克有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]