一种新亚型CaMKIIα3的基因及克隆方法、表达的蛋白及其应用技术

ＣａＭＫⅡα新亚型及基因序列和应用，从猴脑皮层组织克隆出的钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱａｌｐｈａ（ＣａＭＫⅡα）新的异构体ＣａＭＫⅡα３，该异构体ｃＤＮＡ编码框全长１２６６ｂｐ，编码有４２１个氨基酸的蛋白质，分子量４７５１９道尔顿，等电点ｐＩ为８．０２。ＣａＭＫⅡα在神经科学学习与记忆机制研究中起着重要作用，被认为是一种“记忆分子”。ＣａＭＫⅡα的表达量下降和老年痴呆症有关。ＣａＭＫⅡα３在大鼠和狗前脑皮层中没有发现；作为新的ＣａＭＫⅡα亚型的异构体，可参与高级哺乳动物的高级神经认知，作为学习记忆相关疾病及老年痴呆症的药物靶标，并为基因治疗和药物开发等提供新的研究方向。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)，特别是猴脑中一种新亚型CaMKIIα3的基因、克隆方法、鉴定方法及其应用。
技术介绍
钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在大脑组织中大量表达。其表达具有神经细胞特异性和脑区特异性，而且表达量和神经系统发育相关、是构成突触后密度的主要成分。CaMKIIα具有广泛的底物，并具有钙离子依赖活性和自身磷酸化的特性。CaMKIIα在过去的二十多年中成为神经科学家们研究的焦点，并被公认为“记忆分子”。大量实验证据也表明CaMKIIα确实在突触可塑性、LTP等学习与记忆机制中起着重要的作用。随着衰老，CaMKIIα在脑中的表达量和活性明显下降，研究显示CaMKIIα与老年痴呆相关的tau蛋白和淀粉样前体蛋白(APP)的磷酸化有关，并发现在老年痴呆脑中的CaMKII磷酸化水平下降，而且在大脑的海马区表达量也明显下降。CaMKIIα是CaMKII家族中在进化中出现的最晚的一种亚型，仅存在于鸟类和哺乳动物中。在哺乳动物中，CaMKIIα的序列是高度保守的。在mRNA水平上，大鼠的CaMKIIα的的编码区序列和人的有93％同源性。而在蛋白水平，大鼠和人的CaMKIIα的氨基酸序列是完全一致的。包括CaMKIIα在内CaMKII家族的四种亚型在结构上都具有一定的相似性，即从N端到C端分别为催化区、自主调节区和结合区。CaMKII的各亚型之间的主要区别是位于结合区内的一小段多变区，各亚型的不同异构体也是由于多变区的不同剪切形成的。CaMKII家族成员β、γ、δ亚型均具有多种异构体(分别为8种、13种、15种)，与之不同的是，CaMKIIα在小鼠、大鼠和人类中仅发现3种异构体，而在脑中仅存在两种，分别为CaMKIIα和CaMKIIαB。CaMKIIαB和CaMKIIα的区别在于CaMKIIαB比CaMKIIα在结合区的多变区增加了一段33bp的外显子，即多了11个氨基酸。GenBank中的序列号分别为小鼠CaMKIIα(BC031745)、大鼠CaMKIIα(NM_012920)、人CaMKIIα(BC040457)和人CaMKIIαB(NM_015981)(小鼠、大鼠的CaMKIIαB尚未上传至GenBank)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亚型CaMKIIα3的cDNA序列，并提供克隆该序列及鉴定该序列是否表达的方法。使其一方面可以用于学习与记忆机制的研究，另一方面CaMKIIα3可作为老年痴呆症的新药物靶标，同时对于大脑疾病、学习记忆相关疾病及老年痴呆症等的基因治疗和药物开发提供新的途径。本专利技术的技术方案如下编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ No1所示，或者编码SEQ No2的氨基酸序列。钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型蛋白，具有SEQ No2的氨基酸序列。所述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因的克隆方法，包括以下步骤a)提取脑组织总RNA；b)反转录得到cDNA；c)PCR扩增。其中PCR扩增使用以下一个或多个引物a)5’-AGCCTCACCTGCCTGCCCAGCGCCAGGATG-3’b)5’-GAGGCAGGACGGGGTGACTCCCTGGTCCGA-3’c)5’-TCAGAGAGCACCAACACCACCATCG-3’d)5’-GGATGTAGGCGATGCAGGCTGACTC-3’e)5’-AAGCACCCCTGGATCTCGCACC-3’f)5’-GCAGGCTGACTCGTCGCCCATC-3’含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因序列的载体。含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因序列的感受态细胞。含有上述编码钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亚型CaMKIIα3的基因及其表达的蛋白用于制备治疗老年痴呆症的药物。具体方法如下从猴脑组织中提取总RNA，猴脑中CaMKIIα和CaMKIIαB的cDNA序列，GenBank中核酸序列Blast结果显示其和小鼠的CaMKIIα同源性为94％，和大鼠的CaMKIIα同源性为94％，和人的CaMKIIα、CaMKIIαB同源性为98％。而翻译成的氨基酸序列也是完全一致的。该结果进一步证明了CaMKIIα在进化上的高度保守性，但同时也说明，同为高级哺乳动物灵长类的猴和人的CaMKIIα的一致性更高，进化上更相近。本专利技术的CaMKIIα3作为一种新的CaMKIIα异构体，也具有和人的CaMKIIα的98％同源性，但相对于人的CaMKIIα缺失了两段共171bp的外显子，即缺失了57个氨基酸。CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的编码氨基酸序列比对结果如下猴的CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的编码氨基酸序列比对结果(MultipleSequence Alignment by CLUSTALW网址http//align.genomejp/)Human_CaMKIIα_BMATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_ MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREMonkey_CaMKIIα_3 MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_BARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_ ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILMonkey_CaMKIIα_3 ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_BEAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_ EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLMonkey_CaMKIIα_3 EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_BSPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLV本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码钙离子／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱａｌｐｈａ（ＣａＭＫⅡα）的新亚型ＣａＭＫⅡα３的基因，其特征在于，其ｃＤＮＡ核苷酸序列如ＳＥＱＮｏ：１所示，或者编码ＳＥＱＮｏ：２的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王露，胡应和，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]