用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列制造技术

本文描述了使植物中转基因表达受到特异调节控制的表达盒，其中所述表达盒包括来自ＭＡＲＳ基因家族的调控序列，用于在植物的繁殖组织中表达重组基因产物从而产生非生物性压力耐受植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术包括含有来自靶基因的调控序列的表达盒，例如，来自MADS基因家族的调控序列，用于在植物中组织特异性的表达重组基因产物。
技术介绍
在农业生物工程学上，植物可根据需要被加以修饰。完成这一任务的一条途径是利用现代遗传工程技术。例如，通过将目的基因引入植物中，植物就可被特异性的修饰以表现需要的表型特性。为此，非常普遍地采用含启动子区、编码区和终止区的异源基因转化植物。当遗传改造某一异源基因以便于在植物中表达时，启动子的选择常常是一个关键的因素。尽管某些基因可能需要组成型表达，即在所有时间内都在整株植物中以及在大部分组织和器官中表达，但其它基因更需要只响应特定的刺激才表达或者局限于特殊的细胞或组织内。启动子由启动子完全发挥作用所必需的几个区域组成。其中的一些区域是模块式的，换而言之它们可单独使用以使其具有启动子的活性，或者它们可与其它元件装配在一起构建成新的启动子。这些启动子区的第一个区位于编码序列的紧邻上游并形成含有一致序列的“核心启动子”，通常是位于编码序列紧邻上游的20-70个碱基对。核心启动子区包含TATA盒且常常是起始元件及起始位点。核心启动子区的准确长度不是固定的，但通常是可以很好的被识别的。这样的区域通常存在于大部分启动子中，也许有某些变化。位于各种已充分表征的元件之间的碱基序列较不重要。核心启动子区常常被称为最小的启动子区，因为它自身就能发挥作用而促进基础水平的转录。核心启动子区的存在就确定了某一序列是启动子如果没有该区域，启动子就无功能。核心区的作用在于将一般的转录系统吸引到启动子上以起始转录。不过，核心启动子区不足以提供完全的启动子活性。通常位于核心区上游的一系列调控序列组成了启动子的其余部分。调控序列决定了表达水平、表达的空间和时间模式，以及对于某些启动子而言，决定了在诱导条件下的表达(受诸如光、温度、化学物质和激素等外界因素的调节)。调控序列可以是6-100个碱基对长的短DNA序列区，确定了诸如转录因子等反式作用因子的结合位点。调控序列还可以是增强子，较长的DNA序列区，可从离核心启动子区较远的位置发挥作用，有时离核心区相隔数千个碱基。调控序列活性可受反式作用因素影响，包括一般的转录系统、转录因子和染色质装配因子。研究中常常需要目的基因在植物中组织特异性的表达。组织特异性启动子专一地启动某一批组织中的表达，而不是在整株植物中表达；组织偏好的启动子在某亚类组织中启动高水平表达，而在植物的其它组织中则启动的表达处于显著较低水平。例如，研究者可能需要使某一增值产物只在玉米粒中表达而不在植物的其余部分表达。另一例子是通过组织特异性切除造成雄性不育。组织特异性启动子可以在植物生长周期的特定时间或时间段表达于特定的组织中。不过，表达水平足够高的基因产物，尤其是那些被定向在特定组织中表达的基因产物，还是难以获得的(Iyer M.等(2001))。已知mRNA的5′非翻译前导序列、内含子和mRNA的3′非翻译区影响特定基因的表达。例如，Sieburth，L.E.和Meyerowitz，E.M.(1997)报道了基因内序列似乎是拟南芥MADS盒基因AGAMOUS(AG)基因表达所必需的，以花朵发育正常的早和稍晚的独特表达模式体现。Larkin J.C.等人(1993)报道了缺失拟南芥GLABROUSI(GL1)基因的3′非编码区负面影响了GL1的功能。不过，迄今为止，辨别和确定特定的调控区并将它们掺入固定特性投递平台中是仍未完成的工作。本专利技术的重要方面是以发现来自MADS基因家族的DNA序列在开发于植物繁殖组织中表达重组基因的强表达盒中格外有用。专利技术简述本专利技术包括许多不同的方面，包括通过鉴别来自MADS基因家族的调控序列并将所述序列掺入用于在植物繁殖组织中表达重组基因产物的表达盒内而对植物中的转基因表达进行特定调节控制。本专利技术涉及如下方法通过鉴别靶基因，利用相应的cDNA序列分析gDNA序列以鉴别靶基因的调控序列，并将一种或多种调控序列掺入具有核酸分子的表达盒中，由此构建表达盒。用本专利技术表达盒转化的植物以模拟靶基因表达的方式表达核酸分子的产物。本专利技术涉及植物中转基因表达的特异调节控制，包括使转基因定向表达于玉米、稻和其它单子叶植物内正在发育的繁殖组织中。本专利技术表达盒的用途包括表达葡萄糖或蔗糖转运蛋白以提高繁殖组织储备能力(sink strength)。储备能力也可通过花朵特异性表达转化酶基因或者一种或更多种海藻糖代谢基因而得以提高。本专利技术进一步包括通过特异转运蛋白的表达增加来增强小分子摄取的能力。定义术语“开放阅读框架”和“ORF”指编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间序列所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指在编码序列中分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)起始和链终止的三个毗连核苷酸组成的单位(“密码子”)。术语“非生物性压力”指对植物具有不利影响的无生命的环境因素，诸如霜冻、干旱、过热、大风等。术语“核酸”指高分子量的多核苷酸，可以是单链或者双链，由含糖、磷酸和嘌呤或嘧啶碱基的单体(核苷酸)组成。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)则涉及将DNA中所含信息转移到蛋白质中。“基因组”是生物体各个细胞中所含的遗传物质的总体。术语“核苷酸序列”指DNA或RNA多聚体，可以是单链或双链，任选的含有合成的、非天然的或改造过的能掺入DNA或RNA多聚体中的核苷酸碱基。除非另外指出，不言自喻本专利技术的具体核酸序列还包括其保守性修饰的变体(如简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，通过产生其中一个或多个选定(或者全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列可完成简并密码子置换(Batzer等Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Bio1.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。“可操作性的连接”指单个核酸片段中核酸序列的相互联系从而使某一序列的功能受到另一段序列的影响。例如，当启动子能影响编码序列或功能性RNA的表达时(即，编码序列或功能性RNA受启动子的转录调控)，则它是与编码序列或功能性RNA可操作性连接的。有义或反义方向的编码序列可与调控序列可操作性的连接。“启动子”指某一段核苷酸序列，通常在其编码序列的上游(5′)，通过提供RNA聚合酶的识别以及正确转录所需的其它因子来调控编码序列的表达。“启动子调控序列”包括最接近的和稍远的上游元件。启动子调控序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列包括增强子、启动子、非翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然的和合成的序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。“增强子”是可刺激启动子活性的DNA序列，它可能是启动子的内在元件或者是被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。它能以两种方向(正常的或者翻转的)发挥功能，并且在即使移动到启动子的上游或下游的情况下仍能发挥作用。术语“启动子”的意思包括“启本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在植物繁殖组织中表达核酸分子产物的表达盒，其中包含：ａ）ＭＡＤＳ基因的启动子、第一个外显子、第一个内含子和第二个外显子，其中所说的启动子、第一个外显子、内含子和第二个外显子是所说表达盒的５′－调控序列；其中所说的５′－调控序列已被改造成大约在所说５′－调控序列的３’－末端有翻译起始密码子，且不包含妨碍用重组ＤＮＡ方法进行操作的限制性内切核酸酶位点或在所说翻译起始密码子上游的另外的翻译起始密码子；ｂ）ＭＡＤＳ基因的３′－调控序列；和ｃ）与所说的５′－调控序列和所说的３′－调控序列可操作性连接的核酸分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：ML努乔，ML拉格里米尼，M迈格吉，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]