云杉毛虫DNA复制原点识别蛋白第六亚基基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及昆虫基因工程技术领域，特别是涉及一种云杉毛虫ＤＮＡ复制原点识别蛋白第六亚基ＣｆＯＲＣ６基因及其应用。本发明专利技术所分离的基因长１０１４ｂｐ，编码３３８个氨基酸，分子量约４２ｋＤ。利用云杉毛虫ＤＮＡ复制原点识别蛋白第六亚基基因，采用ＰＣＲ和融和ＰＣＲ方法构建ＣｆＯＲＣ６突变体，并利用ＣｆＯＲＣ６突变体插入到杆状病毒多角体蛋白的启动子下，病毒大量表达突变ＣｆＯＲＣ６，直接引起宿主细胞死亡，提供了ＣｆＯＲＣ６突变体在重组杆状病毒杀虫剂中的应用。ＣｆＯＲＣ６的功能特点为设计高效的新型重组杆状病毒杀虫剂奠定基础，而且为进一步研制癌症的基因治疗载体提供理论依据和实践指导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及昆虫基因工程
，特别是涉及一种云杉毛虫DNA复制原点识别蛋白第六亚基(CfORC6)基因及其应用。二、技术背景云杉毛虫(Choristoneura fumiferana)是一种重要的森林害虫，能被云杉毛虫核型多角体病毒(CfMNPV)特异感染致死，但需要较长的时间。由于某些宿主蛋白和病毒蛋白在病毒感染宿主细胞时可能与病毒DNA复制相关，并且可能与病毒的毒力及宿主域有关。DNA复制是个严格控制的细胞过程，与细胞周期的其它环节密切协调。真核生物DNA复制研究是国际上非常活跃的前沿领域。复制原点识别蛋白第六亚基(ORC6)参与真核生物DNA复制，与细胞有丝分裂有关。在人、果蝇、酵母菌及云杉毛虫细胞中都有ORC6的同源蛋白。在云杉毛虫的部分基因组EST已被测定出来的基础上，我们以果蝇的ORC为探针进行BLAST搜索时得到了包含DmORC6的同源序列的cDNA质粒，即CfORC6，利用RT-PCR方法获得并保存了该基因的菌种。CfORC6是继酵母(ScORC6，美国加州大学，1993)，果蝇(DmORC6，美国冷泉港实验室，2000)及人的ORC6(HsORC6，美国哈府医学院，2000)之后新鉴定的DNA复制原点识别蛋白第六亚基，其特证在于，CfORC6与DmORC6和HsORC6具有约30％同源性，与ScORC6无同源性；在原核中表达的分子大小与预测一致，分子量与ScORC6大小相似，是DmORC6和HsORC6的1.6～1.7倍，即CfORC6分子量与SCORC6相似，与DmORC6和HsORC6却差异悬殊，但与DmORC6和HsORC6的同源性高。Southern blot证明CfORC6为单拷贝基因，但Northern blot表明其转录信号却比同是单拷贝基因的Hsp90弱得多，这些特别之处与CfORC6的分子功能有关。重组杆状病毒杀虫剂一般采用Bt基因、蝎毒基因、昆虫自身的激素基因及P53死亡蛋白，由于这些基因有的来源于其它物种，存在基因安全问题；来源于自身的技术等原因需要较长的生理过程，因而病毒杀虫剂的效果一直不够理想。CfORC6与DNA复制和细胞分裂有关，其突变可以直接引起细胞死亡，过量产生突变的CfORC6直接导致细胞死亡，省却了较长的生理过程，无疑可提高毒力。CfORC6的功能特点为设计高效的新型重组杆状病毒杀虫剂奠定基础，而且为进一步研制癌症的基因治疗载体提供理论依据和实践指导。我国于2004年上市的癌症基因治疗载体为Adv-P53，通过P53一系列信号传导途经才能将死亡信号传给癌细胞，最终导致癌细胞的死亡。而ORC6能直接与DNA结合，如果其复制功能域或细胞分裂功能域部位缺失或突变，可以直接引起细胞DNA不能复制、细胞不能分裂而死亡，预计癌细胞死亡时间会更短。综上所述，蛋白第六亚基CfORC6基因的研究，不仅具有重要的理论价值，而且对医学和农业领域也有应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种云杉毛虫DNA复制原点识别蛋白第六亚基CfORC6基因；本专利技术另一目的是利用云杉毛虫DNA复制原点识别蛋白第六亚基CfORC6基因及其突变体在获得重组杆状病毒杀虫剂中的应用。本专利技术的技术方案一种云杉毛虫DNA复制原点识别蛋白第六亚基CfORC6基因，该基因全长cDNA序列，具有如下所示的1014bp的核苷酸序列1 atggcttcgt acaataaaac tcttcaactt ctagcatcaa aaatgggtct aagggaggaa61 gataaagtgt taagtaaggc tgccgagttt gaacgactac tgcagactaa aactgttgcc121 gggagcaact tgagcgacac gagcaaggtg gtgatctgtc ttgacttagc tgcaggcatt181 tatggagtcg aattagatgt gaaaacagca gtgaaatact cgggtctgaa gccagtagca241 tatacaagta accgcaagac tgtggaaaac cttctagagc tgaacaccag caagctatcg301 gtgccattgc tgtgtgtctc cttgcagtgc acgggggttc aggagactgc tgtaaagata361 cttgaggagt accagagaca tgcaaaagtg gaggtggatc taagtctccc acaatatgta421 tgcatggctg tatttcaagc ttgtagaatt aacaaagtga aagtgtcgaa agtcaaaata481 aacgagaaat gtcgcctgaa gcctgcacaa tgggccaagc ttgaggctga ctgggctagc541 tttgtgaacg agaaattcaa catcgccaag aaaaaaaggg ggaggcctgc caagaatgct601 gtgaacagtg atgataatca agagatggaa gcagattcta aagaggaagg ccccacggaa661 attgagatag aaccatatga gacttggaaa cagcgcatgc tagaaagcgc ctatgaagaa721 ctcaaacaat taaagatgaa agaaaatgag actaggctga aatcgcctag aaaagccaca 781 gttaaagaaa ctaataaaat cttatcgaaa gaagttacta tgggtacccc gcagaaaaaa841 gttactaggg gtaccccaca aaaagaggtt tctaggggta ccccacaaaa agttactagt901 ggaaccccat cgaaagaaat actaggggta gcccacaaaa agaggtttct agaggtaccc961 cacacaaaga agttactaga tatacgccac cggaagatat gtttggaaat atcc。所述的CfORC6基因编码的蛋白，编码长为338个氨基酸，蛋白的氨基酸序列为1 MASYNKTLQL LASKMGLREE DKVLSKAAEF ERLLQTKTVA GSNLSDTSKV51 VICLDLAAGI YGVELDVKTA VKYSGLKPVA YTSNRKTVEN LLELNTSKLS101 VPLLCVSLQC TGVQETAVKI LEEYQRHAKV EVDLSLPQYV CMAVFQACRI151 NKVKVSKVKI NEKCRLKPAQ WAKLEADWAS FVNEKFNIAK KKRGRPAKNA201 VNSDDNQEME ADSKEEGPTE IEIEPYETWK QRMLESAYEE LKQLKMKENE251 TRLKSPRKAT VKETNKILSK EVTMGTPQKK VTRGTPQKEV SRGTPQKVTS301 GTPSKEILGV AHKKRFLEVP HTKKLLDIRH RKICL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种云杉毛虫ＤＮＡ复制原点识别蛋白第六亚基ＣｆＯＲＣ６基因，其特征是：该基因全长ｃＤＮＡ序列，具有如下所示的１０１４ｂｐ的核苷酸序列：１ａｔｇｇｃｔｔｃｇｔａｃａａｔａａａａｃｔｃｔｔｃａａｃｔｔｃｔａｇｃａｔｃａａａａａｔｇｇｇｔｃｔａａｇｇｇａｇｇａａ６１ｇａｔａａａｇｔｇｔｔａａｇｔａａｇｇｃｔｇｃｃｇａｇｔｔｔｇａａｃｇａｃｔａｃｔｇｃａｇａｃｔａａａａｃｔｇｔｔｇｃｃ１２１ｇｇｇａｇｃａａｃｔｔｇａｇｃｇａｃａｃｇａｇｃａａｇｇｔｇｇｔｇａｔｃｔｇｔｃｔｔｇａｃｔｔａｇｃｔｇｃａｇｇｃａｔｔ１８１ｔａｔｇｇａｇｔｃｇａａｔｔａｇａｔｇｔｇａａａａｃａｇｃａｇｔｇａａａｔａｃｔｃｇｇｇｔｃｔｇａａｇｃｃａｇｔａｇｃａ２４１ｔａｔａｃａａｇｔａａｃｃｇｃａａｇａｃｔｇｔｇｇａａａａｃｃｔｔｃｔａｇａｇｃｔｇａａｃａｃｃａｇｃａａｇｃｔａｔｃｇ３０１ｇｔｇｃｃａｔｔｇｃｔｇｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔｔｇｃａｇｔｇｃａｃｇｇｇｇｇｔｔｃａｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｔａａａｇａｔａ３６１ｃｔｔｇａｇｇａｇｔａｃｃａｇａｇａｃａｔｇｃａａａａｇｔｇｇａｇｇｔｇｇａｔｃｔａａｇｔｃｔｃｃｃａｃａａｔａｔｇｔａ４２１ｔｇｃａｔｇｇｃｔｇｔａｔｔｔｃａａｇｃｔｔｇｔａｇａａｔｔａａｃａａａｇｔｇａａａｇｔｇｔｃｇａａａｇｔｃａａａａｔａ４８１ａａｃｇａｇａａａｔｇｔｃｇｃｃｔｇａａｇｃｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｇｃｃａａｇｃｔｔｇａｇｇｃｔｇａｃｔｇｇｇｃｔａｇｃ５４１ｔｔｔｇｔｇａａｃｇａｇａａａｔｔｃａａｃａｔｃｇｃｃａａｇａａａａａａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｃａａｇａａｔｇｃｔ６０１ｇｔｇａａｃａｇｔｇａｔｇａｔａａｔｃａａｇａｇａｔｇｇａａｇｃａｇａｔｔｃｔａａａｇａｇｇａａｇｇｃｃｃｃａｃｇｇａａ６６１ａｔｔｇａｇａｔａｇａａｃｃａｔａｔｇａｇａｃｔｔｇｇａａａｃａｇｃｇｃａｔｇｃｔａｇａａａｇｃｇｃｃｔａｔｇａａｇａａ７２１ｃｔｃａａａｃａａｔｔａａａｇａｔｇａａａｇａａａａｔｇａｇａｃｔａｇｇｃｔｇａａａｔｃｇｃｃｔａｇａａａａｇｃｃａｃａ７８１ｇｔｔａａａｇａａａｃｔａａｔａａａａｔｃｔｔａｔｃｇａａａｇａａｇｔｔａｃｔａｔｇｇｇｔａｃｃｃｃｇｃａｇａａａａａａ８４１ｇｔｔａｃｔａｇｇｇｇｔａｃｃｃｃａｃａａａａａｇａｇｇｔｔｔｃｔａｇｇｇｇｔａｃｃｃｃａｃａａａａａｇｔｔａｃｔａｇｔ９０１ｇｇａａｃｃｃｃａｔｃ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王小纯，艾里克卡斯特恩，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]