一个CENP-E结合蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一个ＣＥＮＰ－Ｅ结合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个ＣＥＮＰ－Ｅ结合蛋白及其编码基因与其在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。该蛋白是下述氨基酸序列之一：１）序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１；２）将序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与ＣＥＮＰ－Ｅ蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的蛋白质。该蛋白通过与ＣＥＮＰ－Ｅ和微管的相互作用参与细胞有丝分裂的纺锤体检查点信号转导途径，可以其为活性成分作为调控肿瘤细胞增殖的药靶，本发明专利技术的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个CENP-E结合蛋白及其编码基因与其在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。
技术介绍
细胞精确地自我复制是其生活史的重要组成部分，复制的高保真性在生物及物种的繁衍生息过程中举足轻重。在细胞复制的过程中，包含在染色体中的父代遗传信息在经历了诸多复杂的运动之后均等、准确地传递给两个子细胞。细胞周期事件是高度有序进行的，保证细胞周期有条不紊行进的生化调控道路被称为“检验点”(checkpoint)。动点是位于着丝粒上的多组份蛋白质复合结构，它不仅直接维系纺锤体丝与染色体的衔接，同时要调控染色体运动及染色体分离的时空序列性及保真性，此信号通路被称为“纺锤体检验点”(spindle checkpoint)。纺锤体检验点失控可导致细胞复制过程中非整倍体及染色体不稳定性的产生，并可能参与肿瘤的发生与发展。但迄今为止，纺锤体检验点信号通路的蛋白质作用网络及其信息流传递的分子机制仍不清楚。动点马达蛋白CENP-E(centromere associated protein E)是一个分子量为312kD的动点蛋白，包含一个位于N端的与驱动蛋白类似的马达域和包含2069个氨基酸残基的coiled-coil结合域。人源CENP-E总长为2701个氨基酸残基(薛宇等，2006.哺乳动物驱动蛋白的计算基因组学分析与鉴定.科学通报，511654-1665)。CENP-E是一个直接负责动点对纺锤体微管捕获的马达蛋白，它与其它纺锤体检查点蛋白一起协调细胞有丝分裂的进行(Yao et al.，2000.CENP-E forms a link betweenattachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitoticcheckpoint.Nature cell Biology.NCB.2484-491)。CENP-E的缺失使纺锤体检验点失活，产生染色体不稳定性(Weaver et al.，2007.Aneuploidy acts bothoncogenically and as a tumor suppressor.Cancer Cell.1125-36.)。因此，寻找纺锤体检验点调控蛋白及CENP-E结合蛋白是一项非常有意义的研究工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个调控染色体运动的动点马达蛋白CENP-E的结合蛋白。本专利技术所提供的CENP-E结合蛋白，名称为CENP-V，其基因来源于人睾丸细胞，是下述氨基酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与CENP-E蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO1由523个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第64-179位氨基酸残基为典型的亮氨酸富集域，自N端第208-342位及第504-517位氨基酸残基为coiled-coil结构域。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。编码上述CENP-E结合蛋白CENP-V的基因(CENP-V)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且与CENP-E蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID NO2由1572个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1569位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第192-537位碱基编码亮氨酸富集域，自5’端第624-1026位碱基和第1512-1551位碱基编码Coiled-coil结构域。含有本专利技术基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增CENP-V中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制CENP-V基因表达的方法。本专利技术所提供的抑制CENP-V基因表达的方法，是将抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA或其编码基因导入宿主，CENP-V基因的表达被抑制。所述抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA，可为正义链为序列表中的序列3，反义链为序列表中的序列4的双链RNA序列。将双链RNA序列命名为CENP-V siRNA。CENP-V siRNA的反义链与CENP-V mRNA(GenBank号BC050665.)距离CENP-V cDNA起始密码子ATG 965-990位置序列5’-gcaagauugccaaauucgaggagaa-3’互补，序列表中SEQ ID NO3由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID NO4由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。上述抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA的编码基因可为有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。上述具有双链寡核苷酸序列编码基因命名为CENP-V siDNA，编码CENP-V siRNA。序列表中序列5由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列6由25个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。本专利技术提供了一个与CENP-E相互作用的动点蛋白，它在有丝分裂的早期与CENP-E共定位于动点，到中期染色体在赤道板上正确排列后离开动点并移往中心体，末期定位到中体，由于该蛋白和CENP-E直接相互作用于动点，因此将其命名为CENP-V。CENP-V呈细胞周期依赖性表达，在有丝分裂中期表达量最高，此外，电镜观测结果表明CENP-V在核膜破裂后，定位到染色体动点的最外层，在染色体被捕获直到染色体在赤道板上正确排列的过程中，CENP-V分布于纤维冠状层上。CENP-V的coiled-coil区域后200个氨基酸残基负责其动点定位及与CENP-E的相互作用。微管共沉降实验证实CENP-V是一种与微管直接相作用的蛋白，并通过CENP-V的氨基端(N端)与微管相互作用。利用RNAi敲除技术抑制CENP-V基因的表达的实验结果表明，敲除CENP-V基因可以引起染色体的错误分离，并降低姐妹染色体的张力。实时活细胞监测结果表明，敲除CENP-V基因可以引起细胞周期的阻滞。上述实验结果表明，本专利技术的CENP-V是一个动点蛋白，通过与CENP-E和微管的相互作用参与细胞有丝分裂的纺锤体检查点信号转导途径，可以其作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＣＥＮＰ－Ｅ结合蛋白，是下述氨基酸序列之一：　　　　１）序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１；　　　　２）将序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与ＣＥＮＰ－Ｅ蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪彪，都建，丁霞，花沙沙，刘丹，王峰松，金长江，蔡欣，袁凯，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]