烟草属核酸分子及其应用制造技术

本发明专利技术的特征是烟草属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）核酸序列诸如在烟草属植物中编码组成性，或乙烯或衰老诱导的多肽，特别是细胞色素ｐ４５０酶的序列，以及使用这些核酸序列的方法，和例如通过使用育种方法改变理想性状的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在烟草属(Nicotiana)植物中的烟草属核酸序列诸如编码组成性，或乙烯或衰老诱导的多肽，特别是细胞色素p450酶(下文称为p450和p450酶)的序列，以及使用这些核酸序列改变植物表型的方法。背景在烟草成熟或熟化过程中，各种基因的表达被改变。这些基因可以影响涉及许多次级代谢物形成的代谢途径，所述次级代谢物包括类萜，多酚和影响终产物质量性状的生物碱。例如，在许多烟草属物种中，在植物衰老和在收获后或叶熟化阶段过程中，发生烟碱形成去甲烟碱的生物转化。烟碱是去甲烟碱的主要来源。去甲烟碱生物碱是微生物介导的亚硝化作用的底物，以在叶熟化或随后的叶贮存和处理过程中形成烟草特异性的亚硝胺(TSNA)N′-亚硝基去甲烟碱(NNN)。在烟草成熟或熟化过程中表达的基因可以是组成性表达的、乙烯诱导或衰老相关的基因，例如编码细胞色素p450的基因。细胞色素p450s，例如催化广泛范围的在化学上不相似的底物的酶促反应，其包括内源性和异生底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，p450s参与生化途径，所述生化途径包括植物产物诸如所研究的phenylpropanoids，生物碱，类萜，脂质，氰苷和芥子油苷的合成(Chappell，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46521-547，1995)。细胞色素p450s，也已知为p450血红素-硫醇盐蛋白质，通常充当被称为包含p450的单氧化酶系统的多成分电子传递链中的末端氧化酶。由这些酶系统催化的具体反应包括脱甲基作用，羟基化作用，环氧化作用，N-氧化作用，硫代氧化作用，N-、S-、和O-脱烷基化，脱硫作用，脱氨作用和偶氮、硝基和N-氧化物基团的还原作用。烟草属植物p450酶的多样作用涉及对多种植物代谢物的影响，所述植物代谢物诸如phenylpropanoids，生物碱，类萜，脂质，氰苷，芥子油苷和许多其它的化学实体。一些p450酶可以影响植物代谢物的组成。例如，长期以来，理想的是通过育种来改变植物的选定脂肪酸的模式从而改善某些植物的香味和香气；然而关于涉及控制这些叶组分的水平的机制知道的很少。与脂肪酸改变相关的p450酶的下调或上调可以促进需要的脂肪酸的积累，这提供了更为优选的叶表型的品质。关于p450酶的功能和它们在植物组成中的更多作用仍旧在发现中。例如，发现一类特殊的p450酶催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和β-醇，其是水果和蔬菜的“鲜绿”气味的主要起作用的因素。可以改变其它新的目标p450s的水平，从而通过改变在烟草属叶中的脂质组成和相关的分解代谢物来提高叶子组分的品质。这些叶组分中的一些受到刺激叶品质成熟的衰老的影响。还有其它的报道显示p450s酶在改变脂肪酸中具有功能性作用，所述脂肪酸涉及植物-病原体相互作用和疾病抗性。大量多样的p450酶形式，它们不同的结构和功能使得在本专利技术之前他们进行对烟草属p450酶的研究非常困难。此外，因为这些膜定位的蛋白质典型地以低丰度存在并且通常在纯化过程中是不稳定的，p450酶的克隆至少部分被阻碍。因此，存在鉴定植物中p450酶和与那些p450酶相关的核酸序列的需要。具体而言，烟草属中仅有一些细胞色素p450蛋白质已经进行了报道。本文所述专利技术基于它们的序列同一性，发现了对应于数类p450物种的细胞色素450s和细胞色素p450片段。除了p450序列之外，本专利技术包括其它组成性和乙烯或衰老诱导的序列的发现，其解决了调节涉及次级代谢物形成的代谢途径的需要，所述次级代谢物影响烟草产品的品质。这些序列还用在植物生殖质的开发中，所述植物生殖质具有理想的性状以用于开发更理想的生殖质，尤其是非-GMO(遗传修饰的生物)类型的生殖质的育种程序中。专利技术概述本专利技术人已经鉴定和表征了组成性，及乙烯和衰老诱导的序列，包括来自烟草的烟碱脱甲基酶的基因组克隆。还在本文中描述的是，这些序列在育种方法和在产生具有理想性质的植物(例如，转基因植物)的方法中的应用，所述理想性质诸如相对于对照植物，去甲烟碱或N′-亚硝基去甲烟碱(″NNN″)或两者的改变的水平。在一方面，本专利技术的特征是产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤(a)提供具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物；(b)提供包含至少一个表型性状的第二烟草植物；(c)使所述第一烟草植物与所述第二烟草植物杂交以产生F1子代植物；(d)收集不同烟碱脱甲基酶基因的表达的F1子代的种子；和(e)萌发所述种子以产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物。在一个实施方案中，使用本文所述的序列和本领域已知的标准方法将烟草植物鉴定为烟碱脱甲基酶基因表达的变体(例如，在转录、翻译后或翻译水平上或在酶活性水平上)。在该育种方法的另一个实施方案中，所述第一烟草植物包含具有突变(例如，缺失、取代、点突变、易位、倒位、复制或插入)的内源烟碱脱甲基酶基因。在另一个实施方案中，所述第一烟草植物包含具有无效突变的烟碱脱甲基酶基因，包含使内源烟碱脱甲基酶基因沉默的重组基因，或包含具有减少的或改变的酶活性的烟碱脱甲基酶。在另一个实施方案中，第一烟草植物中的烟碱脱甲基酶基因不存在。在另一个实施方案中，所述第一烟草植物是转基因植物。用在本文公开的育种方法中的示例性第一烟草植物包括Nicotianaafricana，Nicotiana amplexicaulis，Nicotiana arentsii，Nicotianabenthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotiana corymbosa，Nicotiana debneyi，Nicotiana excelsior，Nicotiana exigua，Nicotiana glutinosa，Nicotianagoodspeedii，Nicotiana gossei，Nicotiana hesperis，Nicotiana ingulba，Nicotiana knightiana，Nicotiana maritima，Nicotiana megalosiphon，Nicotianamiersii，Nicotiana nesophila，Nicotiana noctiflora，Nicotiana nudicaulis，Nicotiana otophora，Nicotiana palmeri，Nicotiana paniculata，Nicotianapetunioides，Nicotiana plumbaginifolia，Nicotiana repanda，Nicotianarosulata，Nicotiana rotundifolia，黄花烟草(Nicotiana rustica)，Nicotianasetchelli，Nicotiana stocktonii，Nicotiana eastii，Nicotiana suaveolens或Nicotiana trigonophylla。理想地，所述第一烟草植物是Nicotianaamplexicaulis，Nicotiana benthamiana，Nicotiana bigelovii，Nicotianade本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物的育种方法，所述方法包括下列步骤：　　　　（ａ）提供具有不同烟碱脱甲基酶基因表达的第一烟草植物；　　　　（ｂ）提供包含至少一个表型性状的第二烟草植物；　　　　（ｃ）使所述第一烟草植物与所述第二烟草植物杂交以产生Ｆ１子代植物；　　　　（ｄ）收集具有所述不同的烟碱脱甲基酶基因的表达的所述Ｆ１子代的种子；和　　　　（ｅ）萌发所述种子以产生具有减少的烟碱脱甲基酶基因的表达的烟草植物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：许冬梅，MT尼尔森，
申请(专利权)人：美国无烟烟草公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]