视网膜肌养蛋白转基因及其应用方法技术

进行性假肥大性肌营养不良（ＤＭＤ）是一种由肌养蛋白基因的严重缺陷所引起的进行性肌肉疾病，可导致患者在２０到３０岁之间死亡。本发明专利技术利用双突变小鼠（ＤＭ）作为合适的人ＤＭＤ模型，因为这些小鼠的肌养蛋白和肌养蛋白相关蛋白都有缺陷（ｍｄｘｌ＋，ｕｔｒｎ－／－），在３个月时死亡，患有严重的肌无力、明显的生长迟缓、脊柱后凸、体重下降、姿态松弛以及运动能力下降。新型人视网膜肌养蛋白Ｄｐ２６０转基因的表达被证明可防止过早死亡，将严重的肌营养不良表型缓解到轻微的临床肌病的程度。肌电图描记术、组织学、放射影像学、磁共振成像以及行为试验证明，转基因ＤＭ小鼠生长正常，有正常的脊柱弯曲和运动能力，肌肉病变减轻。转基因ＤＭ小鼠的ＥＭＧ和组织学数据表明，转基因ＤＭ小鼠的异常症状可降低到轻微肌病的典型水平，而ＤＭ小鼠却出现了人肌营养不良疾病所常见的严重异常症状。转基因ＤＭ小鼠还表现出与未处理ｍｄｘ小鼠和对照相似的可检测运动水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请以下申请要求序列号为60/588,700(2004年7月16日提交)；60/608,252(2004年9月9日提交)；以及60/613,026(2004年9月24日提交)的临时申请的优先权，其教义和内容通过引用纳入本文。序列表本申请包含计算机可读形式和纸件形式的序列表。计算机可读形式的拷贝标记为34444.txt Copy 1和34444.txt Copy 2。这些拷贝彼此相同，并且与本文所包含的序列表纸件拷贝相同。每个序列表都已通过引用特地纳入本申请。
技术介绍
专利
本专利技术涉及进行性假肥大性肌营养不良(DMD)。更具体地说，本专利技术涉及DMD的新模型以及治疗DMD的方法。更具体地说，本专利技术涉及一种新型转基因、包含该转基因的载体以及将该转基因引入动物DNA以表达肌养蛋白的方法。更具体地说，本专利技术涉及利用新型转基因进行DMD的体内治疗。现有技术描述进行性假肥大性肌营养不良(DMD)是男孩最常见的神经肌肉病。这是一种性染色体连锁的隐性遗传病，其特征是进行性的肌肉退化，导致在十多岁时发生重度残疾，在20到30岁的早期到中期发生致命的心功能或呼吸功能衰竭。目前还没有能够延长生命或明显改善该疾病临床进程的方法。标准的治疗方法主要集中在维持患者的总体健康状况以及改善其生活质量上。虽然有多个研究表明糖皮质激素(如强的松龙)可延缓肌肉强度的下降速度，但是其效应维持时间相对较短(28-36个月)，并且无法改变该疾病的临床进程。肌养蛋白基因的突变导致了肌养蛋白表达的缺失，从而产生了DMD。427kDa的肌养蛋白同种型将膜内在蛋白连接到肌动蛋白骨架上，这被认为可以在肌肉活动时起到稳定肌纤维膜的作用。当缺乏肌养蛋白时，膜丧失了机械稳定性，发生钙流入，最终导致肌纤维坏死。肌养蛋白是一种多结构域蛋白，由N端肌动蛋白结合结构域、含24个血影蛋白样重复序列的杆状结构域、半胱氨酸富集结构域以及C端结构域组成。后两个结构域与DAP(肌养蛋白相关蛋白)复合体的蛋白质和肌养蛋白结合蛋白结合。肌养蛋白基因79个外显子的另路剪接可产生几种肌养蛋白同种型，范围从71kDa到全长427kDa。至少有7个独立的启动子驱动7种不同肌养蛋白同种型的转录，以细胞特异性的方式表达。mdx小鼠已被用作人DMD的遗传模型。mdx小鼠在其生命的前6周就会显现出肌营养不良的症状，但是与人DMD不同，其随后的疾病进程是温和的。成年mdx小鼠的四肢肌肉并没有呈现出如人DMD所见的显著衰弱或严重的进行性退化。mdx小鼠的膈膜确实发生与人DMD肌肉一样的变性和坏死，但是小鼠却不会发生呼吸损伤，其寿命也正常。肌养蛋白相关蛋白(utrn)是能与肌养蛋白相关蛋白相互作用的肌养蛋白的常染色体同源物，它可以补偿mdx小鼠肌肉肌养蛋白的缺乏。肌养蛋白相关蛋白表达水平上升最大的肌肉所表现出的损伤最小。但是，这种补偿替代不会发生在人类身上，这可能可以解释mdx小鼠和人DMD之间的表型差异。相应的，本领域所需要做的一件事情就是寻找一种人DMD的遗传模型，该模型具有与人DMD一样的表型特征和临床表现。本领域还需要找到表达肌养蛋白或其同源物的基因。本领域还需要包含表达肌养蛋白或其同源物的基因的载体，该载体能够转染动物的基因组，这样肌养蛋白基因或其同源物就可以表达，从而可以补偿肌肉内肌养蛋白的缺乏。还需要的是利用已转染肌养蛋白或其同源物表达DNA的细胞治疗DMD的方法。还需要的是利用表达肌养蛋白或其同源物的基因所表达的游离蛋白质治疗DMD的方法。最后需要的是利用载体治疗DMD的方法，其中载体转染到被感染动物的基因组内，肌养蛋白或其同源物表达，从而补偿肌肉内肌养蛋白的缺乏。专利技术概述本专利技术解决了在先技术所固有的问题，使技术水平有了明显的提高。概括地说，本专利技术的一个方面包括一种游离的转基因，该基因包含人视网膜肌养蛋白的同种型，被命名为Dp260，以及合适的调节元件。本专利技术的另一方面提供了将此Dp260转基因引入或插入载体以将基因插入到动物基因组内，从而使其表达视网膜肌养蛋白的方法。优选的，动物选自哺乳动物，更优选的是选自人、小鼠、犬或马，最优选的动物是人。本专利技术的相关方面提供了含Dp260转基因的动物。在本专利技术另一方面，Dp260转基因可用于转化骨髓细胞和成肌细胞，用于动物肌营养不良的基因治疗中。优选的动物是哺乳动物。更优选的动物选自小鼠、犬、马或人。在本专利技术的另一方面，Dp260转基因用于其他合适的载体内，或者结合其他合适的转染方法，如脂质体转染，用于肌营养不良基因治疗的其他方法中。在本专利技术的另一方面，将Dp260所表达的蛋白质给予需要的动物。本专利技术的一个实施方式构建自人Dp260的DNA序列。人Dp260是肌养蛋白的同种型，由肌养蛋白基因独特的第一外显子R1与外显子30经过另路剪接而产生。人视网膜肌养蛋白包含肌养蛋白所具有的半胱氨酸富含结构域、C端和大部分杆状结构域，但缺乏肌养蛋白的N端肌动蛋白结合结构域。另外，次级肌动蛋白结合结构域位于人Dp260的血影蛋白重复序列内。人Dp260在视网膜内正常表达，与肌动蛋白和肌养蛋白相关蛋白共同定位。它还具有肌养蛋白的许多功能。在这个实施方式中，转基因构建自人视网膜肌养蛋白和合适的调节元件。合适的人Dp260序列可来源于ATCC克隆57670、57672、57674和57676，可通过本领域熟知的技术直接克隆到质粒内。为了实现本专利技术，用于转基因中的优选DNA序列具有与人Dp260相同的功能，更优选的是，转基因的Dp260部分的DNA序列与人Dp260有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、再优选至少95％、再优选至少97％、最优选的是99-100％的序列相同性。本专利技术的转基因序列还可以是肌养蛋白经过另路剪接而形成的同种型。可用于实现本专利技术的肌养蛋白的一种另路剪接形式包含肌养蛋白的外显子71。在优选的形式中，最终的转基因还包含位于Dp260序列上游的启动子和增强子序列，这些序列可促进转基因的表达。优选的调节元件包括小鼠肌肉肌酸激酶(MCK)启动子和增强子，以及作为调节元件的小鼠MCK外显子1和2。转基因表达可通过将转基因稳定转染到细胞系内，然后分析蛋白产物的序列来检测。剪接中出现的错误可通过常规的定点突变技术加以修复以提高正确剪接位点的外显子受体得分。在其他优选的形式中，转基因还含有其他的调节位点以确保所得到的转录子具有适宜的稳定性。一种这样的调节位点是添加到构建物3’末端的牛生长激素(BGH)poly A信号序列，该序列可确保进行适当的多聚腺苷酸化。在其他实施方式中，本专利技术包括含在适合转染其他细胞的载体内的Dp260转基因及其上述的相关调节元件。这种载体优选包含表达蛋白质的DNA序列，该蛋白质具有与肌养蛋白相似的功能。优选的是，用于这种载体内的DNA序列与人Dp260有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％，最优选的是99-100％的序列相同性。在某些优选形式中，载体还包含一种形式的人Dp260，该序列包含人肌养蛋白的外显子71。在更优选的形式中，载体还包含如上所述调节元件，如启动子、增强子和poly A信号位点。该载体可以是各种市售质粒、腺病毒或慢病毒。在其他实施方式中，本专利技术包括被Dp260转基因转染的动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化的载体，其包含：编码肌养蛋白的核酸序列，所述载体在转化前不包含所述核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R怀特，R加伊迪克，K菲茨杰拉德古斯塔夫松，
申请(专利权)人：儿童慈善医院，
类型：发明
国别省市：US[美国]