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人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品技术

技术编号:1713575 阅读:223 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
人甲状旁腺激素(PTH)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品,属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠PCR技术,将HAS  cDNA和PTH  cDNA进行拼接,中间不加入任何连接肽,得到的PTH-HSA  cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中,在宿主系统中进行表达。本发明专利技术的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85%序列同源的第一区和与人甲状旁腺激素至少85%序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下,进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人甲状旁腺激素生理特性的基础上,延长其在体内的半衰期,改善其溶解度,在药学领域有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法,其特征是从新鲜人甲状旁腺组织中分离单核甲状旁腺细胞,刺激培养,提取RNA;通过RT-PCR反转录得到PTHcDNA;通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSAcDNA;利用重叠P CR技术,连接HSAcDNA和PTHcDNA,中间不加入任何连接肽,得到的PTH-HAScDNA融合基因插入到克隆载体,PTH-HAScDNA融合基因在宿主系统中进行表达,PTH-HAScDNA融合基因被整合到宿主的染色 体中;(1)PTHcDNA的克隆:以RT-PCR反转录得到的PTHcDNA第一链为模板,通过PCR扩增出PTHcDNA,所用的引物如下:p1:5’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC -3’p2:5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下:50μl的反应体系中加入:10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfu   Buffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,PTHcDNA第一链1μg,加双蒸水补齐50μl,PCR条件为:95℃变性10分钟,94℃变性1分钟,65℃退火1分钟,72℃延伸90秒,循环35次;通过琼 脂糖凝胶电泳分析反应产物,在加样泳道出现目标条带,用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.27kb的目标片段,纯化好的目标片段和载体pBluescriptⅡKS(+)分别经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切;琼脂糖凝胶电泳纯化,用PCR片段胶回 收试剂盒回收,用T↓[4]连接酶连接两酶切后纯化好的片段;连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板,37℃培养过夜;随机挑取5个单菌落,接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜,提取质粒;通过PCR,及EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆,并对重组质粒EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点间区域进行DNA测序;阳性重组子保存在含有15%甘油的LB中,冻存于-80℃;重组质粒命名为pBlue-PTH,阳性重组子命名为DH5α/pBlue-PTH;(2)HSAcDNA的克隆:利用PCR从人胎肝cDNA文库...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:沈微金坚诸葛健王俊张莲芬
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:32[中国|江苏]

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