一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，首先对瞬时表达载体的构建，其次对质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养，最后将农杆菌菌株的介导瞬时表达，记录叶片的过敏反应情况。本发明专利技术通过直接接种新的瞬时表达载体pCAMBIA2300‑LIC:PVY‑NIB来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，鉴定方法简单有效，适应大量育种材料鉴定的需求，且简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫（南方根结线虫）的抗性筛选鉴定。

A rapid identification method of tobacco resistance to the root knot nematode in the South

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法。
技术介绍
烟草根结线虫病在上世纪80年代以后，其病害程度不断扩展，危害逐渐加大，已经成为了我国烟草的主要病虫害之一，造成的损失非常之大。其不仅会造成烟草质量变差，生长缓慢，并且会造成整株死亡情况的出现。因此，如何有效地防治根结线虫病已成为当前我国烟叶生产中急需解决的问题。由于受环境和经济水平的约束，大部分缺水旱作烟区无法开展防治效果较好的水旱轮作，从而多采用化学手段防治，虽然取得一些较好的效果，但也造成了农药高残留、高毒性、烟叶品质的下降和环境污染的结果，因此选育和推广抗病品种是防治烟草根结线虫病最经济有效的方法之一。我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种鉴定，鉴定技术与结果不仅受环境影响较大，而且不能快速、大量的鉴定烟草种质资源和以及用于对杂种后代材料的筛选，限制了抗病育种的有效开展。可靠、快捷的烟草抗根结线虫鉴定技术是培育和利用抗病烟草品种控制根结线虫病的关键之一。以往的我国烟草抗根结线虫鉴定主要通过田间病圃和人工接种鉴定，耗时时间长，不适用于对大批材料进行快速鉴定。烟草品种抗根结线虫与感染PVY-MSNR产生枯斑是同一基因所致，具有一因多效性，同时，烟草品种抗根结线虫与感染PVY-MSNR产生枯斑对于温度和叶龄具有同一的敏感性。这种一因多效性被广泛地用于烟草抗根结线虫病育种，相关研究证明PVY-MSNR复制酶(PVY-NIB)是烟叶接种病毒后在抗线虫品种上产生枯斑反应的诱导因子。病毒接种鉴定法具体操作是在烟草苗期将PVY-MSNR病毒接种到叶片上，7～10天观察叶片是否产生枯斑反应，出现枯斑即为抗病品种，否则为感病品种，以此筛选烟草抗南方根结线虫品种。
技术实现思路
本专利技术的目的就是鉴于上述理论建立一套更加完备且快速有效的抗性鉴定技术，通过此鉴定方法的运用能够有效对抗根结线虫病的烟草品种进行育种。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：(1)瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQIDNO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；(2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；(3)农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6～8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。进一步，所述步骤(1)中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQIDNO.1；其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。进一步，步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法转化农杆菌菌株LBA4404，得到农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和LBA4404/pCAMBIA2300-LIC菌液。进一步，步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法分别转化农杆菌C58C1，得到农杆菌C58C1/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和C58C1/pCAMBIA2300-LIC菌液。进一步，所述步骤(3)中光合培养箱中的条件为白天温度设置为26℃，16个小时；夜晚温度设置为18℃，8个小时。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术构建新的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB，并优选利用C58C1感受态细胞进行转化，更好地对烟草抗根结线虫的抗性准确地鉴定。2、本专利技术的鉴定方法所选试验材料为苗龄6～8周的烟草叶片，克服了传统鉴定方法周期长、易受自然条件的影响等缺点，在很大程度上提高了品种抗根结线虫的鉴定速率。3、本专利技术通过直接接种新的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB来鉴定烟草品种对南方根结线虫的抗性，鉴定方法简单有效，适应大量育种材料鉴定的需求，且简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫(南方根结线虫)的抗性筛选鉴定。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：(1)瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQIDNO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；(2)质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；(3)农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6～8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤(2)中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。其中，所述步骤(1)中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQIDNO.1；其次，将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。所述步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA通过冻融法转化农杆菌菌株LBA4404，得到农杆菌LBA4404/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和LBA4404/pCAMBIA2300-LIC菌液。或，所述步骤(2)中将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）瞬时表达载体的构建：人工合成PVY‑NIB基因，其序列为SEQ ID NO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300‑LIC中，构建pCAMBIA2300‑LIC:PVY‑NIB瞬时表达载体；（2）质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300‑LIC:PVY‑NIB和空载体pCAMBIA2300‑LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300‑LIC:PVY‑NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300‑LIC:PVY‑NIB菌液；（3）农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6~8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤（2）中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）瞬时表达载体的构建：人工合成PVY-NIB基因，其序列为SEQIDNO.1，并克隆到空载体pCAMBIA2300-LIC中，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体；（2）质粒DNA的转化及农杆菌菌株的培养：将构建好的瞬时表达载体pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB和空载体pCAMBIA2300-LIC质粒DNA分别转化农杆菌菌株，并将转化好的农杆菌菌株进行培养，得到农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液和农杆菌菌株/pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB菌液；（3）农杆菌菌株的介导瞬时表达：烟草试验材料种植于光合培养箱中，试验选取6~8周的烟草真叶片，用去掉针头的1ml无菌注射器吸取步骤（2）中的菌液，涂在叶片上，使叶片浸润，再放入光合培养箱中，连续观察叶片的过敏性反应情况并记录。2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定烟草对南方根结线虫抗性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建的具体过程为：首先，将PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，分别在序列5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，合成序列SEQIDNO.1；其次，将pC...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐世晓，薛刚，杨铁钊，李晓辉，王袁，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41