黑色素细胞悬浮液的保存方法技术

本发明专利技术关于一种黑色素细胞的保存方法。将黑色素细胞制成悬浮液后可保存于４－２２．５℃的温度范围内，其中新生儿黑色素细胞悬浮液的保存温度较佳为４－１５℃间，保存４８小时后仍然保持７１％以上的细胞存活率和活性。成人黑色素细胞的保存温度较佳约为１０－２２．５℃间，保存２４小时后亦保有７２％以上的细胞存活率和活性。同时，于此温度范围下，可避免黑色素细胞聚集（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）的情形产生。该黑色素细胞悬浮液可用以治疗皮肤白化症（ｌｅｕｋｏｄｅｒｍａ），及其它黑色素细胞缺乏的症状。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术关于一种粘附性细胞悬浮液的保存方法，更具体地，关 于一种。
技术介绍
白化症(Leukoderma)中的白斑病(Vi t i 1 i go)为 一 种斑状色素缺 失疾病，约发生在1% 2%的人口中，其临床症状为皮肤或黏膜上出 现不规则的白色斑块，白斑病患部上的黑色素细胞几乎全数缺失。 在白斑病的治疗方面，除了利用染剂或化妆品的染色与遮盖方式夕卜， 也可利用局部涂抹类固醇制剂，或植皮的方式治疗，然而这些方法 除了不适用于大面积之外，也可能会产生皮肤萎縮等副作用。目前治疗白斑最常使用的方法为口服或外用的感光剂(如 Psoralen)与长波长紫外光(UVA)的合并治疗，或是窄频UVB治疗。 但这些治疗方式疗程冗长， 一般需要100到250次治疗，为时l到 2年。此外，经过此冗长的疗程后，大约只有50%的病人能得到明 显疗效。另一种较新颖的治疗方式是藉由黑色素细胞的移植来进行 治疗，此种黑色素细胞移植治疗法与前述口服、照光等相比，仅需 数次门诊，且几周之内就可看到色素再现，疗效迅速而明显。由于黑色素细胞为粘附性细胞，故在培养此类型细胞时必须有 可粘附的基材与适当的培养基。因此，在临床上使用培养的黑色素 细胞来治疗皮肤白化病灶时，须考滤培养基的去除及粘附基材的处 理等因素。其中，关于粘附基材的处理方式可以有下列三种方式 第一，将细胞与所粘附的基材一同覆盖到病灶上，然而此方式需要 考滤生物兼容性/生物可分解性等因素而开发适合的粘附基材，技 术上较复杂困难；第二，将细胞从粘附基材上分离后，与水胶混合 再覆盖到病灶上，此方式成本较昂贵，且多一道处理步骤；第三， 将细胞从粘附基材上分离，和生理兼容液体混合(也即制成细胞悬浮液)，再移植到病灶上。此三种方式相较，以第三种方式(制成细胞 悬浮液)较易于进行，也较经济实惠。然而当粘附性细胞(例如黑色素细胞) 一 旦被制成细胞悬浮液 时，由于失去细胞粘附分子的讯号传递，往往在短时间内即死亡； 此外，该细胞也容易聚集沉降，难以打散，若将此聚集细胞团移植 到要治疗的无色素病灶上(例如白斑症)，则会因细胞分布不均而形 成色素斑点；再者，若要作后续的细胞培养，聚集细胞团不能均匀 分布于培养皿，也会妨碍培养效果。因此，如何制备并保存该细胞 悬浮液是一个重要课题。传统上，细胞的保存多以低温冷冻(例如储存于液态氮)的方式 进行，以达到长期保存的效果。但是对于需立即使用，而不需再经 处理的细胞(例如运送到医院供病人治疗用的细胞)，则并不适合以 上述的低温冷冻方式保存。因为冷冻细胞时需加入特殊试剂，例如 DMSO来防止冷冻对细胞造成伤害，而这些试剂无法直接用于临床上。 再者，低温冷冻的细胞运送保存时需用干冰或液态氮或其它方式来 维持低温状态，造成运送保存困难。此外，冷冻细胞的使用需一定 的解冻程序，故也存在使用便利性的问题。临床应用的细胞悬浮液， 一般是以非冷冻的方式保存于室温下。科学上一般将室温视为25°C。然而细胞对温度非常敏感，不同的环境温度会对细胞生理有不同的影响，如果要达到好的保存效果，必 须找出最适的保存温度范围，而室温未必是最适合的保存温度。一 个非冷冻、且温度低于最适合细胞生长的环境，或许能降低细胞化 学反应及代谢速率，进而延长细胞寿命。但该低温环境也可能造成 细胞内的蛋白质结构改变、细胞生长周期变慢，甚至是使酵素功能 丧失等，进而造成细胞的死亡。此外，当细胞回温使用时，也常会引发不良的热休克反应(heat shock),造成细胞的再度损伤。因此， 寻找合适的低温环境，使之同时满足降低代谢速率而延长细胞寿命 及最低的细胞伤害是一个重要的课题。然而，目前关于非冷冻保存方式对于细胞影响的了解很有限， 其中关于低温环境对粘附性细胞影响的研究，仅限于粘附于培养皿 上的粘附性细胞，并未对制备成悬浮液的粘附性细胞作研究。而且，温度因子对特定细胞的影响，例如低温对黑色素细胞的影响，更是 付之阙如。综合上述，当粘附性细胞，尤其是黑色素细胞，被制成细胞悬 浮液商品化时，其运送过程及临床手术前存放的保存条件皆足以影 响到该细胞的活性、存活率及细胞在溶液中分布的均匀性。因此， 粘附性细胞的细胞悬浮液的最佳化保存条件已经成为研究目标。因此，本专利技术关于粘附性细胞悬浮液的保存，尤其是黑色素细 胞悬浮液的保存，特别是以非冷冻的方式保存黑色素细胞悬浮液， 使细胞活性和存活率受到最佳保护，同时避免细胞聚集。
技术实现思路
本专利技术提供一种黑色素细胞的保存方法，先将黑色素细胞制备成悬浮液，较佳以汉氏培养液(Ham' s Nutrient Mixture F-12 ， Ham' sF12)配制，再分别于约4-22. 5 °C温度范围下，保存该黑色素 细胞悬浮液，其中成人黑色素细胞悬浮液较佳的保存温度范围约为 10-22. 5t之间，于此温度范围，24小时后成人黑色素细胞仍保有约 72 。/。以上的活性及存活率，并且细胞无聚集现象。而新生儿黑色素 细胞悬浮液较佳的保存温度范围约为4-15t之间，于此温度范围下， 48小时后新生儿黑色素细胞仍保有约71 %以上的活性及存活率。依照本专利技术的 一 个较佳实施例，黑色素细胞的悬浮液也可由杜 贝可最低基本培养液(Dulbecco， s Modified Eagle media， DMEM)、 最低基本培养液(Minimal Essential Medium, MEM)、磷酸生理食盐 7jC (phosphate buffered saline, PBS)、罗斯威尔帕克纟己念机构1640 培养液(Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium, RPMI 1640 Medium)、 一般生理食盐水(normal sal i ne)或其它生理兼容溶液所 配制。本专利技术还提供一种，该黑色素细 胞悬浮液用于治疗缺乏黑色素细胞疾病，该方法包含制备黑色素细 胞悬浮液，于约4-22.5'C温度范围内保存黑色素细胞悬浮液。与传统低温保存方式相比，本专利技术是利用悬浮液的方式，不需 低温冷冻即可保存黑色素细胞，且本专利技术的黑色素细胞悬浮液可保存至少24小时，对于远距离运送而言，24小时的运送时间已相当充裕，无论是否马上使用或将黑色素细胞悬浮液暂存于前述适合的保 存温度，对于黑色素细胞的活性及存活率的影响差异不大，同时也 降低细胞聚集的情形。由于传统悬浮液的治疗方式，被黑色素细胞的保存所局限，因 此，本专利技术在医疗用途上或对于黑色素细胞的商品化具有极为显著的效益。附图说明为让本专利技术的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对附图的详细说明如下图1是依照本专利技术的一个较佳实施例的黑色素细胞保存条件实 验的概括流程图；图2是本专利技术的一个较佳实施例的黑色素细胞悬浮液的制备流 程图；图3是本专利技术的一个较佳实施例的新生儿黑色素细胞保存实验 的流程图；图4是本专利技术的一个较佳实施例的成人黑色素细胞保存实验的 流程图-,图5是本专利技术的一个较佳实施例的新生儿黑色素细胞保存实验 的统计长条图；图6是本专利技术的一个较佳实施例的成人黑色素细胞保存实验的 统计长条图；图7A至图7G显示本发 胞于不同温度下的聚集情形图8A至图8D显示本发 胞保存在DMEM、于不同温度图9A至图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑色素细胞悬浮液的保存方法，其特征在于，以非室温（２５℃）条件进行保存处理，包含：制备黑色素细胞悬浮液；于约４－２２．５℃温度范围内，保存该黑色素细胞悬浮液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：施冰如，廖智菁，申屠子萍，杨莹蓉，吴怡萍，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]