一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体制造技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，是由SEQ ID NO.1所示序列通过5’ Pstl和 3’ Sacl克隆至载体pCAMBIA2300‑LIC获得，并提供了该瞬时表达载体的构建方法。本发明专利技术通过人工合成PVY‑MSNR株系复制酶基因PVY‑NIB，以pCAMBIA2300‑LIC为植物表达载体，构建农杆菌瞬时表达载体，建立新的烟草抗根结线虫病品种基因鉴定技术体系。实现简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫的抗性筛选鉴定。本发明专利技术建立的新的瞬时表达载体用于烟草抗南方根结线虫育种程序中，能够极大地缩短育种年限。

A transient expression vector for identification of tobacco resistance to the root knot nematode in the South

The present invention provides an expression vector for instant identification of tobacco for resistance to meloidogyneincognita, by SEQ ID NO.1 shown in sequence obtained by 5 'and 3' Pstl Sacl cloned into the vector pCAMBIA2300 LIC, and provides the instantaneous expression vector construction method. The present invention by artificial synthesis of PVY strain MSNR replicase gene PVY NIB plant expression vector with pCAMBIA2300 LIC, Agrobacterium mediated transient expression vector construction, the establishment of the new tobacco root knot nematode resistant varieties gene identification system. To achieve a simple, accurate, rapid and high throughput screening and identification of resistance to tobacco root knot nematode. The new transient expression vector is used in the breeding program of tobacco resistance to the root knot nematode, which can greatly shorten the breeding years.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体
本专利技术属于微生物基因工程
，具体涉及一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体。
技术介绍
烟草根结线虫病是世界烟叶生产中的主要病害之一。由于杀线剂农药(铁灭可等)的限制应用，抗病品种的利用已成为防治根结线虫病最有效的措施。我国烟草抗根结线虫病的育种还很薄弱，主要是应用美国抗根结线虫病的烤烟品种为亲本，开展兼抗性育种，因此具有抗根结线虫病特性的育成品种其抗性不高，在整个烤烟育种中始终没有针对烟草抗根结线虫病开展育种研究，其主要原因是传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大，准确性不高，限制了烟草抗根结线虫病育种的开展。1963年，美国人在抗南方根结线虫品种叶片上发现了一种严重的叶脉坏死病斑，经过鉴定将其确定为PVY-MSNR新的株系。国外研究人员通过人工接种PVY-MSNR，在抗南方根结线虫品种叶片上引起过敏性坏死反应(枯斑反应)，而在感病品种上未出现症状，以此来筛选抗线虫品种。把这项技术用于烟草抗病育种程序中，能够极大地缩短育种年限。农杆菌介导的瞬时表达技术是目前研究基因功能的常用方法。瞬时表达技术可以实现目的基因短暂的高水平表达，与稳定遗传表达相比，具有操作简便、所需时间短、耗资少、且不受遗传转化难易的影响等优点。
技术实现思路
为解决传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大，准确性不高的技术问题，本专利技术结合
技术介绍
中的理论构建农杆菌瞬时表达载体，用于快速鉴定烟草根结线虫的抗性。同时，利用烟草抗根结线虫病基因鉴定技术在杂种分离世代辅助选择，并应用到烟草抗根结线虫病品种选育程序中，加速育种进程。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，是由SEQIDNO.1所示序列通过5’Pstl和3’Sacl克隆至载体pCAMBIA2300-LIC获得。一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，加入克隆位点后的序列为SEQIDNO.1；(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和步骤(1)中的加入克隆位点后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术通过人工合成PVY-MSNR株系复制酶基因PVY-NIB，以pCAMBIA2300-LIC为植物表达载体，构建农杆菌瞬时表达载体，建立新的烟草抗根结线虫病品种基因鉴定技术体系。实现简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫的抗性筛选鉴定。(2)本专利技术建立的新的瞬时表达载体用于烟草抗南方根结线虫育种程序中，能够极大地缩短育种年限。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，是由SEQIDNO.1所示序列通过5’Pstl和3’Sacl克隆至载体pCAMBIA2300-LIC获得。一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，加入克隆位点后的序列为SEQIDNO.1；(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和步骤(1)中的加入克隆位点后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。本专利技术中，植物表达载体pCAMBIA2300-LIC由韩国首尔大学Kim教授提供，载体大小约10490bp，载体抗性为Kan。实施例1一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)人工合成PVY-NIB的CDNA片段：PVY-NIB的CDNA片段序列参照NCBI，登录号：AF463399.1，在序列5’端加入起始密码子ATG和克隆位点Pstl，在序列3’端加入终止密码子TAA和克隆位点Sacl，制得人工合成的PVY-NIB序列，其序列为SEQIDNO.1，其中序列引物F:CACTTTATTGTGAAGATAGTG，序列引物R:CATGCTTAACGTAATTCAACAG。其具体序列如下(下换线为克隆位点)CTGCAGATGGAGCAAGCTAAGCATTCTGCGTGGATGTACGAAGCTCTGACAGGAAACTTACAGGCAGTGGCAGCAATGAAGAGTCAACTAGTAACCAAGCATGTGGTCAAAGGAGAGTGTCGGTATTTTAAAGAGTTTCTAACCGTGGATACGGAAGCAGAAGCATTTTTCAGGCCTTTAATGGATGCCTATGGGAAGAGCTTATTGAATAGAGATGCATATATAAAAGATATAATGAAGTATTCAAAACCCATAGATGTTGGAATTGTGGATTGTGATGCATTTGAAGAAGCTATAAATAGAGTCATCATTTATTTGCAAATGCATGGTTTTCAGAAATGTGCGTATGTTACTGATGAGCAGGAGATTTTCAAAGCACTAAACATGAAAGCTGCTGTTGGAGCTATGTATGGTGGCAAGAAGAAAGATTATTTTGAACACTTCACTGACGCAGACAAGGAGGAAATTGTTATGCAGAGCTGTCTGCGATTGTACAAGGGCTTACTTGGCATTTGGAATGGATCGCTCAAAGCAGAGCTTCGGTGCAAAGAAAAGATACTCGCAAATAAAACGAGGACATTTACTGCTGCGCCACTGGATACTCTGCTGGGTGGTAAAGTGTGTGTTGACGACTTCAACAATCAATTTTATTCAAAGAATATTGAATGTTGTTGGACAGTCGGAATGACAAAGTTTTATGGTGGTTGGGACAGACTACTTCGGCGTTTACCAGAGAATTGGGTTTATTGCGATGCTGATGGTTCACAATTCGATAGCTCACTCACTCCATATCTGATCAATGCAGTCCTCATCATCAGAAGCACATACATGGAAGATTGGGATGTGGGGTTACAAATGTTGCGCAATCTATACACAGAGATTATCTACACACCCATTTCAACTCCAGATGGAACGGTTGTGAAAAAGTTTAGAGGAAACAATAGCGGCCAGCCTTCGACTGTAGTGGATAACTCTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，其特征在于，是由SEQ ID NO.1所示序列通过5’ Pstl和 3’ Sacl克隆至载体pCAMBIA2300‑LIC获得。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，其特征在于，是由SEQIDNO.1所示序列通过5’Pstl和3’Sacl克隆至载体pCAMBIA2300-LIC获得。2.一种根据权利要求1所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位点Pstl和...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐世晓，薛刚，杨铁钊，李晓辉，王袁，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41