克隆来自烟草的细胞色素P450基因制造技术

本发明专利技术涉及烟草的Ｐ４５０酶和编码Ｐ４５０酶的核酸序列以及使用这些酶和核酸序列来改变植物表型的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
克隆来自烟草的细胞色素P450基因本专利技术涉及烟草(Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文中称为P450和 P450酶)的核酸序列以及使用这些核酸序列来改变植物表型的方法。背景细胞色素P450催化多范围的化学上不同底物的酶反应，包括内源和生物异源 底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，P450参与的生化途径包括植物产物 合成，如类苯丙醇(phenylpr叩anoid)、生物碱、类萜、脂类、生氰糖苷和硫配糖 体(glycosinolate)(Chappel， Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 198， 49:311-343)。细胞色素P450也称为P450-硫醇血红素蛋白，通常作为多成分电子 转移链中的末端氧化酶，此转移链称为含P450的单加氧酶系统。特异催化反应包 括脱甲基、羟基化、环氧化、N-氧化、磺氧化、N-、 S-和0-脱烷基、脱硫、脱氨 基以及氮、硝基和N-氧化基团的还原。烟草植物P450酶的不同作用包括影响多种植物代谢物如类苯丙醇、生物碱、 类萜、脂类、氰糖苷、硫配糖体和其它化学实体的宿主。近几年中，显然一些P450 酶可影响植物的植物代谢物组成。例如，长期以来需要改进某些植物的风味和香 味，这是通过育种改变其所选脂肪酸的分布；然而对于参与控制这些叶组成水平 的机制所知甚少。下调与脂肪酸修饰相关的P450酶可促进所需脂肪酸的积聚，所 需脂肪酸提供更优选的叶表型品质。P450酶的功能和它们在植物组成中的广泛作 用仍有待发现。例如，发现一类特殊P450酶催化脂肪酸分解成不稳定的C6-和C9-醛和-醇，它们是水果和植物"清新(fresh green)"气味的主要贡献者。可改变 其它新靶向的P450水平以提高叶组成的性质，这是通过修饰烟草叶中的脂类组合 物和相关分解代谢物。 一些这类叶组成受衰老影响，衰老刺激叶品质性质的成熟。 其它报导显示P450酶在改变脂肪酸中发挥功能性作用，这些脂肪酸参与植物-病 原体相互作用和疾病抗性。在其它例子中，暗示P450酶参与生物碱的生物合成。降烟碱是烟草(7Wco"朋s "力3CW/ 7)中发现的次要生物碱。假定其生成是通过P450调节的烟碱脱甲基，接 着在N位置酰化和亚硝基化，从而产生一系列N-酰基降烟碱(acylnonicotine)和 N-亚硝基降烟碱。认为由推断的P450脱甲基酶催化的N-脱甲基是烟草中降烟碱生 物合成的主要来源。认为酶是微粒体的，因此迄今为止没有成功纯化烟碱脱甲基 酶，也没有分离参与的基因。此外，假设但没有证明P450酶的活性受遗传控制并也受环境因素的强烈影响。 例如，当植物到达成熟阶段时，认为烟草中烟碱的脱甲基显著增加。另外，认为 脱甲基酶基因包含转座因子，转座因子存在时可抑制RNA翻译。在本专利技术前，P450酶的多样性、它们不同的结构和功能使烟草P450酶的研究 很困难。此外，克隆P450酶至少部分受到阻碍，因为这些膜定位的蛋白质一般存 在丰度低且通常对于纯化不稳定。因此，需要鉴定植物中的P450酶和与这些P450 酶相关的核酸序列。在烟草中仅特别报道了几种细胞色素烟草P450蛋白。本文所 述专利技术包括发现了大量细胞色素P450片段，它们在其序列同一性基础上对应于几 组P450种类。概述本专利技术涉及植物P450酶。本专利技术进一步涉及来自烟草的植物P450酶。本专利技术 也涉及在植物中表达受乙烯和/或植物衰老诱导的P450酶。本专利技术更涉及植物中 有酶活性的核酸序列，例如加氧酶、脱甲基酶等或其它，以及使用这些序列以使 这些酶的表达减少或沉默。专利技术同样涉及植物中发现的P450酶，其所含降烟碱水 平高于降烟碱水平较低的植物。一方面，专利技术涉及核酸序列，它们示于SEQ. ID. 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 49、 51、53、 55、 57、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 73、 75、 77、 79、 81、 83、 85、 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 101、 103、 105、 107、 109、 111、 113、 115、 117、 119、 121、 123、 125、 127、 129、 131、 133、 135、 137、 139、 141、 143、 145和147。在第二个相关方面中，这些核酸序列同一性超过75%的片段被分组，这取决于 它们的区域同一性，区域对应于细胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一个核酸到 终止密码子。代表核酸组和各种类示于表I。第三方面，专利技术涉及氨基酸序列，它们示于SEQ. ID.2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 52、54、 56、 58、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 74、 76、 78、 80、 82、 84、 86、 88、90、 92、 94、 96、 98、 100、 102、 104、 106、 108、 110、 112、 114、 116、 118、 120、 122、 124、 126、 128、 130、 132、 134、 136、 138、 140、 142、 144、 146和 148。在第四个相关方面中，这些氨基酸序列同一性超过71%的片段被分组，这取决 于它们彼此的区域同一性，区域对应于细胞色素P450基序GXRXCX(G/A)后第一个氨基酸到终止密码子。代表氨基酸组和各种类示于表n。专利技术的第五个方面是使用核酸序列，它们示于SEQ. ID. 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 49、 51、 53、 55、 57、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 73、 75、 77、 79、 81、 83、 85、 87、 89、 91、 93、 95、 97、 99、 101、 103、 105、 107、 109、 111、 113、 115、 117、 119、 121、 123、 125、 127、 129、 131、 133、 135、 137、 139、 141、 143、 145和147。在第六个相关方面中，减少或去除烟草植物中的P450酶可用RNA病毒系统暂 时完成。评估所得转化或感染植物的表型变化，包括但不限于分析内源P450 RNA 转录本、P450表达肽和植物代谢物浓度，使用本领域普通技术人员通常可用的技 术。在第七个重要方面中，本专利技术也涉及产生P450酶活性水平改变的转基因烟草 品系。根据专利技术，这些转基因品系包括核酸序列，序列有效使某些酶的表达减少 或沉默，从而导致烟草中的表型效果。这种核酸序列包括SEQ.ID.l、 3、 5、 7、 9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括的核酸序列选自ＳＥＱ．ＩＤ．１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７或１４９。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：D徐，
申请(专利权)人：美国无烟烟草公司，
类型：发明
国别省市：US[]