肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法技术

本申请提供了稳定的基于肽的肉毒神经毒素(BoNT)A型捕获剂、以及作为检测试剂和诊断试剂使用以及在治疗疾病和病症中使用的方法。该申请还提供了使用迭代珠粒原位点击化学制备BoNT A型捕获剂的方法。

Botulinum neurotoxin specific capture agent, composition, method and method of manufacture

This application provides a stable peptide based botulinum neurotoxin (BoNT) A capture agent, as well as a detection reagent and diagnostic reagent, as well as a way to treat diseases and diseases. The application also provides a method for in situ preparation of BoNT click chemistry A capture agent using iterative beads.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肉毒神经毒素特异性捕获剂、组合物、使用方法和制造方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年3月16日提交的美国临时专利申请第62/133,891号的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。
技术介绍
肉毒神经毒素(BoNT)A型是已知的最致命的毒素。BoNT是由细菌属(梭菌属)的一些菌种产生，并且是一种化学去神经锌依赖性蛋白酶，其通过切割突触小泡形成和释放所需的三种SNARE蛋白之一来阻止神经肌肉接点中的Ca2+诱发的乙酰胆碱释放。BoNT/A中毒是通过以下进行的：选择性结合神经元受体，通过受体介导的内吞作用进入细胞，通过pH诱导的易位逃离胞内体，最后在细胞质切割其SNAP-25底物。BoNT/A由结合受体的重链和二硫键连接的催化性轻链(LC)组成。这种二硫键需要是完整的而对神经元产生毒害，但是对于LC在细胞质中起催化作用而需将其破坏。亚域(“带”)在结构上地封闭了完整全毒素活性位点，使得药物诱导的抑制仅仅在带释放后才发生，而这通过细胞质环境的二硫键的还原得以促进。BoNT毒素快速地螯合至运动神经元中，限制了目前基于抗体的疗法，然而分子抑制剂不能进入循环BoNT的封闭活性位点。BoNT是潜在致命性生物武器，又是治疗剂和美容剂，同时伴随着意外的过量给药的风险。仍需要强有力和有效的抑制剂。
技术实现思路
本公开涉及设计成与肉毒神经毒素(BoNT)A型结合的化学合成的捕获剂(称为蛋白质催化的捕获剂或PCC试剂)、制备所述捕获剂的方法、使用所述捕获剂的方法，以抑制BoNTA型以及治疗或预防肉毒中毒或肉毒毒素中毒。在一个方面，本文提供了特异性结合BoNTA型的稳定的合成捕获剂，其中肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中轻链包含酶活性位点，其中捕获剂包含锚定配体和第二配体，其中锚定配体和第二配体选择性结合BoNTA型。在另一方面，本文提供了包含一种以上的本专利技术的特异性结合BoNTA型的合成捕获剂的组合物。在另一方面，本文提供了用于检测生物样品中BoNTA型的方法，包括使用一种以上的本专利技术捕获剂处理生物样品的步骤。在另一方面，本文提供了抑制在有需要的受试者的一个以上的神经元中由肉毒神经毒素A型蛋白介导的SNAP-25切割的方法，所述方法包括向神经元给予有效量的一种以上的本专利技术的捕获剂。在另一方面，本文提供了治疗有需要的受试者肉毒中毒的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种以上的本专利技术的捕获剂。锚定配体在捕获剂的一个实施方式中，锚定配体特异性地结合BoNTA型的酶活性位点。在另一个实施方式中，锚定配体包含式Dab(DNP)-R-Lys(N3)-T-Dab-Pra-L-NH-的环肽，其中N3部分和Pra部分一起表示Tz4键或Tz5键。在另一个实施方式中，锚定配体包含式Inh-1的分子其中R1不存在或者是连接至第二配体的接头。第二配体在一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白上距离肉毒神经毒素A型蛋白的酶活性位点3-10埃的位点。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型轻链。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象。在另一个实施方式中，第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型轻链的第166-179位残基。在另一个实施方式中，第二配体包含式-Pra-NYRWL-Lys(N3)的环肽，其中N3部分和Pra部分一起表示Tz4键或Tz5键。在另一个实施方式中，第二配体包含式L2的分子其中R2不存在或者是连接至锚定配体的接头。在另一个实施方式中，第二配体选自由针对110万单元(element)的大环5-聚体肽文库筛选的BoNT轻链的第166-179位残基构成的表位。在另一个实施方式中，文库针对相同表位的加扰版本是抗筛选的。接头在一个实施方式中，本文所描述的捕获剂包含接头。在某些实施方式中，接头是三肽。例如，接头可以包含氨基酸序列Gly-Aib-Leu或Leu-Aib-Gly。在其它实施方式中，接头包含PEG4。在某些实施方式中，锚定配体和/或第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)或通过1,5-取代的1,2,3-三唑残基(Tz5)连接至接头。在其它实施方式中，锚定配体通过Tz4连接至接头。在某些实施方式中，接头的长度为3-10埃。在其它实施方式中，接头的长度为5-8埃。在其它实施方式中，接头的长度在锚定配体和第二配体之间距离的100％至110％之间。三唑连接在捕获剂的一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，第三配体和第四配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起，并且第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起。在另一个实施方式中，锚定配体和第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起，并且第二配体和第三配体通过1,4-取代的1,3-三唑残基连接在一起，并且第三配体和第四配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基连接在一起。双配体在一个实施方式中，本专利技术的捕获剂是双配体，其包含锚定配体和第二配体。第二配体的非限制性实例也在图16中公开。在某些实施方式中，捕获剂包含式Inh-2的分子其中R3是氢、封端基团(例如，酰胺)，或者包含标记或自发转位肽。性质在某些实施方式中，本文提供的BoNTA型捕获剂在较宽范围的温度、pH、储存时间、储存条件和反应条件下是稳定的，并且在某些实施方式中，捕获剂比可比较的抗体或生物制品更稳定。在某些实施方式中，捕获剂作为冻干粉末储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约-80℃至约60℃的温度下储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在室温下是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在人血清中稳定至少24个小时。在某些实施方式中，捕获剂在约3至约12范围内的pH下是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约60℃的温度下作为粉末在两个月内是稳定的。可检测的标记物在一些实施方式中，捕获剂标记有选自由以下所组成的组的标记物：生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨氧基乙酸酯、19FB、18FB、FITC-PEG3、荧光素和荧光素衍生物(例如，5-羧基荧光素)。在其它实施方式中，捕获剂标记有由64CuDOTA、68GaDOTA、18F、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C和76Br所组成的可检测部分。在其它实施方式中，标记物是荧光标记物。在一个具体实施方式中，可检测的标记物是18F。转位肽在一些实施方式中，捕获剂包含转位肽。这些转位肽允许捕获剂进入真核细胞。在某些实施方式中，这些真核细胞是哺乳动物细胞。在具体实施方式中，这些哺乳动物细胞是人类细胞。在某些实施方式中，转位肽是自发转位肽。任选地，自发转位肽包含氨基酸序列pliylrllrGqf。可以使用的其它转位肽包括HIV-TAT、穿透素、SynB1、SynB2、PTD-4、PTD-5、FHVCoar(35-49)、BMVGag(7-25)、HTLV-II本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白的稳定的合成捕获剂，其中所述肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中所述轻链包含酶活性位点，其中所述捕获剂包含锚定配体和第二配体，并且其中所述锚定配体和第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.16 US 62/133,8911.一种特异性结合肉毒神经毒素A型蛋白的稳定的合成捕获剂，其中所述肉毒神经毒素A型蛋白包含重链和轻链，其中所述轻链包含酶活性位点，其中所述捕获剂包含锚定配体和第二配体，并且其中所述锚定配体和第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白。2.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述锚定配体特异性结合所述酶活性位点。3.根据权利要求2所述的捕获剂，其中所述锚定配体包含具有式Dab(DNP)-R-Lys(N3)-T-Dab-Pra-L-NH-的环肽。4.根据权利要求3所述的捕获剂，其中所述锚定配体包含式Inh-1的分子其中R1不存在或者是连接至所述第二配体的接头。5.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型蛋白上距离所述肉毒神经毒素A型蛋白的所述酶活性位点3-10埃的位点。6.根据权利要求5所述的捕获剂，其中所述第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型轻链。7.根据权利要求6所述的捕获剂，其中所述第二配体特异性结合肉毒神经毒素A型全毒素的封闭构象。8.根据权利要求7所述的捕获剂，其中所述第二配体特异性结合所述肉毒神经毒素A型轻链的第166-179位残基。9.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体包含具有式-Pra-NYRWL-Lys(N3)的环肽。10.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体包含式L2的分子其中R2不存在或者是连接至所述锚定配体的接头。11.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂，还包含接头。12.根据权利要求11所述的捕获剂，其中所述接头是三肽。13.根据权利要求12所述的捕获剂，其中所述接头包含Gly-Aib-Leu或Leu-Aib-Gly的氨基酸序列。14.根据权利要求13所述的捕获剂，其中所述接头包含Gly-Aib-Leu的氨基酸序列。15.根据权利要求13所述的捕获剂，其中所述接头包含Leu-Aib-Gly的氨基酸序列。16.根据权利要求11所述的捕获剂，其中所述接头包含PEG4。17.根据权利要求11所述的捕获剂，其中所述锚定配体和/或所述第二配体通过1,4-取代的1,2,3-三唑残基(Tz4)或通过1,5-取代的1,2,3-三唑残基(Tz5)连接至所述接头。18.根据权利要求17所述的捕获剂，其中所述锚定配体通过Tz4连接至所述接头。19.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述捕获剂包含式Inh-2的分子其中R3是氢、封端基团或者包含标记或自发转位肽。20.根据权利要求19所述的捕获剂，其中所述标记选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨氧基乙酸酯、19FB、18FB、5-羧基荧光素和FITC-PEG3所组成的组。21.根据权利要求19所述的捕获剂，其中所述标记是选...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱克·法罗，詹姆斯·R·希斯，希瑟·道恩·阿格纽，
申请(专利权)人：加州理工学院，英蒂分子公司，
类型：发明
国别省市：美国,US