本发明专利技术属于基因工程药物领域，具体涉及抗菌肽ｃｉｔｒｏｐｉｎ１．１８融合蛋白基因、含有该基因的重组载体合转化体以及该基因的表达产物、体外酰胺化及其用途。本发明专利技术所公开的一种抗菌肽ｃｉｔｒｏｐｉｎ１．１８融合蛋白，含有与抗菌肽ｃｉｔｒｏｐｉｎ１．１８或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其变体。该融合蛋白能同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管，为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新的选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程药物领域，具体涉及抗菌肽citropin 1. 18融合蛋白基因、含有该基因的重组载体和转化体以及该基因的表达产物 和其用途。背景资料新生血管生成，是指从既存的成熟血管形成新的毛细血管网络的过 程，这个过程对于脊椎动物的生理发育和损伤组织的修复是必需的， 同时，许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成，包括肿瘤生长、 心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、银屑病和风湿性关节炎等疾病(Ortega N， Werb Z.. J Cell Sci, 2002， 115(Pt 22): 4201—4214; Sottile J. Biochim Biophys Acta, 2004， 1654(1): 13-22; Hamano Y et al Biophys Res Commun， 2005， 333(2): 292-298)。肿瘤是一种环境因素与遗传因素互相作用而产生的一类疾病，是细 胞中多种基因突变累积的结果。目前，肿瘤化疗技术已经取得了相当 的进步，从而使肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性 淋巴瘤等治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿 瘤90%以上的实体瘤的治疗未能达到满意的效果。药学家和肿瘤学家越 来越深刻地认识到要提高肿瘤治疗的效果，必须从肿瘤发生发展的 机制着手，才能取得新的突破性进展。1971年，Folkman(NEngl JMed， 1971， 285(21): 1182-1186)提出"肿瘤的生长和转移都依赖于新生血 管的生成"的观点。肿瘤的生长取决于肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞 的数量，两者相互依存，任何一种细胞群的增减都会导致另一细胞群的相应增减。循此思路的研究，已有多种抑制新生血管生成的药物，如肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、 kringle5、抗-凝血酶III用于抗肿瘤的研究，有的已经进入临床研究阶 段，它们通过作用于遗传上稳定，不易产生药物抗性的内皮细胞来抑 制肿瘤的生长(R. Kalluri. Cold Spring Harb Symp Quant Biol， 2002， 67: 255-266; Nyberg P et al. Cancer Res， 2005， 65(10): 3967-3979; Maeshima Y et al. J Biol Chem， 2000， 275(28): 21340-21348)。 肿瘤抑素属于胶原蛋白IV a3链的一部分。每一个a3链单体由一个 半胱氨酸丰富的N端7S区，中间的三螺旋区和C端球形非胶原区(NC1) 组成。三条a3链通过NCl区相互作用、三螺旋区的缠绕、7S区的共 价结合构成了三聚体结构。两个三聚体通过NC1区头与头相连。四个 三聚体通过7S区共价连接构成胶原蛋白IV的网状结构。肿瘤抑素由 丽P-9蛋白水解酶从胶原蛋白IV a3链水解而来，分子量为28kD，由 244个氨基酸组成，其中12个氨基酸来源于三螺旋区，232个氨基酸 位于NC1区；有两个活性区 一个具有抗肿瘤细胞增殖作用的靠近C 端的185~203氨基酸之间，另一个具抗肿瘤血管生成作用的接近N端 的54-132氨基酸之间(tum-5)。其抗肿瘤血管生成作用与二硫键无关， 在去除二硫键或将二硫键烷基化时，tum-5的活性不受影响。利用这种 特性将tum-5分成八个肽，人工合成重叠序列来研究其活性区，研究 表明T7肽(74~98)具有与turn-5相同的抗血管生成作用，因此肿瘤 抑素抗血管作用活性区可能位于中间的25个氨基酸。同时T7肽还可 改造成与其具同等作用的易溶的T8肽(MaeshimaYet al. JBiolChem， 2001， 276(34) :31959-31968)。抗菌肽citropinl. 18来源于蓝岭树蛙(Litoria citropa)的皮腺 分泌物，是16个氨基酸残基组成的活性小分子肽，可通过其C末端带 正电荷的极性氨基酸，与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂(PS)产生静电引力作用，使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面。聚集的多肽呈现a-螺 旋结构，非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用伸入细胞膜内层，造成 膜内分子位移、质膜穿孔，从而杀伤肿瘤细胞。目前研究的抗肿瘤药物，基本上都是从抗血管活性、或直接杀伤肿 瘤细胞等单方面着手， 一定程度上作用手段单一，容易产生耐药性。 有些如肿瘤坏死因子a (TNFci),大量的动物试验表明具有强大的抗 肿瘤活性，但临床效果不理想，原因是毒副作用太大。若可以从同时直接杀伤肿瘤细胞和抑制新生血管两方面着手，这为 抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病治疗提供了一条新思路。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题专利技术一种药物能直接杀伤肿瘤细胞和 /或抑制肿瘤新生血管，为抗肿瘤以及和所有与新血管生成相关的疾病 治疗提供了一条新的选择。为解决的上述技术问题，本专利技术公开了涉及含有与抗菌肽 citropin 1. 18或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其 变体的蛋白质。本文将这些融合蛋白通称为"本专利技术的抗菌肽citropin 1.18融 合蛋白"。本专利技术的这些融合蛋白表现出直接杀伤肿瘤细胞和/或抑制 新生血管活性。本文所用术语"蛋白质"和"肽"不局限于但包括蛋白质、多肽 以及肽。所述抗血管生成肽包括但不限于具有抗血管生成活性的肿瘤 抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin )、内皮抑素 (endostatin)、 kringle5、抗凝血酶III或其片段或其变体。本专利技术还涉及双功能(或多功能)融合蛋白，其中抗菌肽cittopin 1.18与两个(或多个)抗血管生成肽结合，任选所述抗血管生成肽是 不同的抗血管生成肽，包括但不限于具有抑制血管生成之特性的肿瘤抑素(tumstatin)、血管生成抑素(angiostatin )、 内皮抑素 (endostatin)、 kringle5、抗-凝血酶III或其片段或其变体。与仅含 有一种抗血管生成肽的抗菌肽citropin 1.18融合蛋白相比，所述双 功能(或多功能)融合蛋白还能表现出协同的抗一血管生成作用。所述的抗菌肽citropin 1. 18为具有序列表中SEQ ID NO. 1所述 的氨基酸序列的肽。在一实施例里，所述的抗血管生成肽优选为具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列的肽。在一实施例里，所述抗菌肽citropin 1.18融合蛋白优选为具有 序列表中SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列的融合蛋白。在本专利技术里， 该融合蛋白命名为"Tumpin"。本专利技术还涉及一类citropin 1.18融合蛋白，其中一个(或多个) 抗血管生成肽，任选为不同的抗血管生成肽与两个相同或不同的抗菌 肽citropin 1. 18分子或其片段或变体结合。另外，本专利技术还包括经化学修饰本专利技术的融合蛋白，以增强生物 活性或调制生物活性。本专利技术还包括编码抗菌肽citropin 1.18融合蛋白的核酸分子以 及含有这些核酸的载体，被这些核酸载体转化的宿主细胞，以及使用 这些核酸、载体和/或宿主细胞制备本专利技术的抗菌肽citropin 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗菌肽ｃｉｔｒｏｐｉｎ１．１８融合蛋白，含有与抗菌肽ｃｉｔｒｏｐｉｎ１．１８或其片段或其变体融合的抗血管生成肽或其片段或其变体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马丽，蔡在龙，雷呈祥，杨生生，储智勇，张术，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军医学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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