一种阿魏酸酯酶的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法，该方法包括以下步骤：１）过滤离心；２）超滤浓缩；３）加热；４）离子交换层析；５）疏水层析；６）分子筛层析。本发明专利技术根据不同种类阿魏酸酯酶的不同理化性质，通过各种分离纯化步骤的有机结合，从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，获得了高活性酯酶。利用本发明专利技术的方法，可提取得到多种阿魏酸酯酶，从而达到了较好的生产效果，在饲料工业中具有较高的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体的说，是一种从瘤 胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法。
技术介绍
阿魏酸酯酶(E.C.3丄1.73,也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶) 是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主 要反应为多糖-阿魏酸酯+1120—阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍 生物)。近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。 秸秆和饲草干物质中约30% ~80%为细胞壁成分，然而，反刍动物 对这些细胞壁的消化利用率不超过50%。因此，细胞壁成为反刍动 物消化秸秆和饲草的瓶颈因素。阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质 素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致 密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤 维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测为消除细胞壁降解限制因 子的关键酶之一。人们发现不仅微生物可以向胞外分泌阿魏酸酯酶，哺乳动物和植 物细胞也可产生阿魏酸酯酶。在此基础上，人们对这些酯酶的纯化和 酶学特性进行了一定的研究，获得了相应的基因、蛋白质序列和三维 结构。目前，对阿魏酸酯酶的纯化研究多集中于从单菌培养液中提取， 分离提取处理过程与其它酶制剂相似，即通过离心除去菌体，然后对 上清液进行超滤、硫酸铵沉淀及各种层析等处理，得到阿魏酸酯酶。 单菌培养液中组分比较单一，阿魏酸酯酶的种类较少，提取过程较为 简单。但对于成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液，则需要更为全面有效的分离步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可从瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液中 分离纯化阿魏酸酯酶的方法，该方法可以全面有效地从成分较为复 杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中分离出各种阿魏酸酯 酶。本专利技术通过各种分离纯化步骤地有机结合，从瘤胃液或培养液中 分离阿魏酸酯酶。具体的说，瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液经过滤离 心、超滤浓缩、加热、离子交换层析、疏水层析及分子筛层析得到阿 魏酸酯酶。本专利技术所提供的方法，其具体操作步骤如下 1 )过滤离心将新鲜的瘤胃液或培养液样品经四层医用纱布过滤， 滤液经20，000xg 4'C离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液备用。2) 超滤浓缩取上清液通过超滤膜进行超滤浓缩。首先通过截留 分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集〈00KDa的部分过10KDa的超 滤膜超滤，弃去〈OKDa的部分，10-100KDa和"00KDa部分浓缩10 倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-l(TC之间，酶 回收率可高达55%。3) 加热根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子 量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70。C加热20-40分钟，10,000 x g 4 'C离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。4) 离子交换层析将分子量MOOKDa的浓缩液和分子量在 10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓縮液透析，浓缩，加入适量 200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和适量去离子水，混句，用强阴离子交 换层析柱Q Sepharose Fast Flow column进行分离，其上柱速度为 0.5mL/min-5mL/min,优选为2mL/min。未结合的物质用50 mM磷酸 钠缓冲液(pH7)洗提，结合的蛋白质用梯度NaCl(O-lM)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透 析，浓缩，溶于适量lM(NH4)2SO4 50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。 5 )疏水层析将离子交换层析后制得的酶液先经0.45)am滤膜过滤， 取适量用强疏水性预装柱HiTrap Phenyl FF column分离，其上柱速度 为0.5mL/min-4mL/min，优选为0.5mL/min。未结合的部分用含1M (NH4)2SO4 50 mM的磷酸钠缓冲液(pH7)洗脱。结合的部分用下降 的梯度(NH4)2SO4(l-0M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗脱。 收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM的磷酸钠缓冲液(pH 7)。6)分子筛层析将疏水层析后制得的酶液经凝胶过滤柱Sephacryl S-200HR 16/60 column层析，用50mM碟酸钠缓冲液(pH7)等度洗 脱，速度为0.5111171^11-lmL/min，优选为0.7mL/min。收集有活性的 部分，浓缩，制得高纯度的阿魏酸酯酶。本专利技术所提供的方法中，加热过程是否进行，可根据样品中阿魏 酸酯酶的热稳定性来决定，加热温度及时间优选为6(TC、 30分钟。本专利技术所提供的方法中，可根据蛋白质的纯化情况，选择性地进 行疏水层析或分子筛层析分离过程。本专利技术所提供的方法中，离子交换层析和疏水层析的梯度洗脱过 程可根据阿魏酸酯酶的出峰时间进行调整。本专利技术所提供的方法，可以从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较 多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，有利 于了解复杂体系中阿魏酸酯酶的概况，获得高活性酯酶。本专利技术在饲 料工业中具有较高的实际应用价值。附图说明图l为利用本专利技术的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过 程中，分子量大于100KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。 图2为图1中阿魏酸酯酶II峰经透析浓缩后进行疏水层析的分离图谱。图3为利用本专利技术的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过程中，分子量为10-100 KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例l肉牛瘤胃液的处理于清晨牛空腹时，通过牛的瘤胃瘘管从瘤胃中抽取瘤胃液 1200mL，经四层医用纱布过滤，滤液经20,000 xg4。C离心30分钟， 去除菌体沉淀，收集1000mL上清液以备超滤等下道工序。取上清液首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集 〈00KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去〈10KDa的部分， 10-100KDa和M00KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块 控制该酶液温度在5'C，酶回收率可高达55%。然后将超滤得到的分子量在10-100KDa之间的100mL浓缩液样品 在60。C加热30分钟，10，000xg4。C离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。实施例2浓缩液样品的处理将分子量M00KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变 性蛋白的浓缩液100mL透析，浓缩，加入等体积200mM磷酸钠缓冲液 (pH7)和2倍体积去离子水，混勻。取0.8mL分子量〉100KDa的样品 用强阴离子交换层析柱Q Sepharose Fast Flow column进行分离，速度 为2mL/min，以50 mM磷酸钠缓冲液(pH 7 )为A液，含lMNaCl的50 mM磷酸钠缓冲液(pH 7)为B液。未结合的物质用30mLA液洗脱， 结合的蛋白质用一个五步梯度30mL 10。/。B液，30mL25。/。B液，30mL 50。/。B液，30mL75n/。B液，100mLB液洗提结合蛋白质，收集有阿魏 酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于3mLl M (NH4)2S04 50 mM的 磷酸钠缓冲液(pH7.0)。取4mL分子量为10-100KD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：１）过滤离心：对瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液进行过滤、离心，除去菌体沉淀，收集上清液；２）超滤浓缩：通过超滤膜对１）中获得的上清液进行超滤浓缩；３）加热：加热浓缩液，然后离心去除沉淀的变性蛋白；４）离子交换层析：用离子交换层析柱分离浓缩液，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，加入适当的缓冲液；５）疏水层析：用疏水层析柱分离，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，加入适当的缓冲液；６）分子筛层析：用分子筛层析柱分离收集有阿魏酸酯酶活性的部分，浓缩。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨红建，岳群，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]