本发明专利技术实施例涉及一种组织透明化液SUT，所述组织透明化液SUT主要由SDS和尿素及TritonX‑100构成。本发明专利技术还涉及该组织透明化液SUT制备及其应用。本发明专利技术实施例提供的组织透明化液SUT降低了透明化液配制的成本及难度，增加了透明化效果，其对心肌的透明化程度优于部分现有透明化液配方。
A tissue transparent liquid SUT and its preparation and Application
The embodiment of the invention relates to a tissue transparent liquid SUT, the transparent liquid SUT is composed of SDS and TritonX urea and 100. The invention also relates to the preparation and application of the transparent liquid SUT of the tissue. The transparent liquid SUT provided by the embodiment of the invention reduces the cost and difficulty of the preparation of the transparent liquid, increases the transparency effect, and has a better degree of transparency to the myocardium than that of some existing transparent liquid formulations.
【技术实现步骤摘要】
一种组织透明化液SUT及其制备和应用
本专利技术涉及一种组织透明化液SUT及其制备和应用。
技术介绍
在单细胞分辨率水平获取可视化的、完整的组织结构信息是科学家们一直以来的梦想。通过对完整组织进行单细胞分辨率成像，可以获得完整组织的三维立体图像，借此可以在器官和系统水平阐明细胞间连接方式及其动态变化，这将会大大提高我们对疾病发生发展过程的认识，因为疾病中单细胞事件最终会导致整个机体健康状况的改变。但组织器官的不透光性成为实现这一梦想的最大阻碍。经典的蛋白定性定量(即确定是哪种蛋白，确定某种蛋白的含量多少)技术包括westernblot、免疫组化、免疫荧光等，其中(1)westernblot通过电泳技术将各种蛋白分隔开来，能对蛋白进行基本的定性定量，但无法确定蛋白在组织中的空间分布位置，更无法获取组织内蛋白分布的三维立体图像；(2)由于组织器官的不透光性，传统的免疫组化与免疫荧光是针对组织切片(包括石蜡切片和冰冻切片)进行,切片厚度<8μm，才利于光线透过及荧光染料的穿透。其中免疫组化得到的是二维图片，无法分析蛋白在组织中的三维立体分布；免疫荧光可以通过对组织孵育荧光染料，然后用共聚焦显微镜进行三维重构，得到蛋白分布的三维立体图像，但传统免疫荧光重构的厚度受切片厚度的限制，得到的三维图像厚度太小(<8μm)，对一些较大的细胞(如左室心肌细胞，直径10～15μm)则无法显示全貌，而且，如果组织切片太厚，荧光染料(如荧光抗体)则无法穿透组织进行蛋白标记，且共聚焦显微镜的发射光也无法穿透组织全层，因此三维重构在应用上有很大的局限，目前多用于拍摄荧光二维图片。由于组织器官的不透光性和传统研究技术的种种局限，我们无法获得完整组织中的蛋白分布情况，试想，如果有一种方法能够使组织拥有足够大的光透过度，从而使共聚焦显微镜的发射光能够穿透组织全层，且通过对组织进行特定处理使得荧光染料也能够穿透组织全层，那么，对较厚的完整组织的单细胞分辨率成像以及获取蛋白在完整组织中的时间空间分布即可实现，这将对揭开生命的奥秘提供一种新的路径，大大提高我们对生命体的认识，同时将会大大提高我们对疾病发生发展过程的认识，促进人类的健康事业。影响组织光透过度的因素有两个：(1)光散射--主要因为不同组织结构层间折射率的差异，其中脂质成分影响最大；(2)光吸收--主要由于内源性生色基团，其中血红蛋白和肌红蛋白占主导。那么提高组织光透过率也相应的有两个途径：(1)尽可能减少不同组织结构层间折射率的差异，尽可能除尽脂质；(2)尽可能除尽组织中的血液及肌红蛋白。组织透明化首先通过多聚甲醛固定组织蛋白、再与丙烯酰胺交联形成组织凝胶复合物，组织凝胶复合物有两个特点：(1)这种复合物可以将蛋白及核酸固定在原位，并可代替脂质，成为构架起细胞的支撑性结构，因而在后续的透明化液清洗过程中可以减少蛋白的丢失；(2)组织凝胶复合物是带有不同大小孔径的，荧光染料可以通过小孔进入组织内部，与目标蛋白结合，因此能够标记较厚的组织，克服传统免疫荧光的缺点。形成组织凝胶复合物后，再通过透明化液清洗组织，除去脂质和内源性生色基团，从而极大的提高组织的光透过度，通过对透明组织孵育抗体及荧光染料、共聚焦成像及3D重构，得到完整组织结构单细胞分辨率水平的可视化信息。组织透明化要求在尽可能保持组织原有形态，蛋白丢失量尽可能少的前提下用最短时间实现最大的光透过度，从而尽可能的还原组织真实的微观结构及其变化信息。这种方法最早可追溯至一个世纪前，但是最初的方法对组织的结构和形态造成了很大的破坏,随后各种方法陆续出现，包括CLARITY，SCALE，SeeDB,3DISCO，CUBIC，PACT-PARS等,各种方法均对揭开生命的奥秘做出了很大贡献，且多数方法均发表在国际权威杂志上。然而各种方法的诞生主要用于神经系统(脑组织)的研究，3DISCO曾被用于其他器官透明，但是它容易引起荧光淬灭。2014年发表在CELL杂志上的透明化方法包括CUBIC和PACT-PARS，其中CUBIC的透明化液包含两种试剂，需要两种试剂依次处理组织；PACT-PARS的透明化液为8％SDS，两种透明化液分别通过循环系统灌注都实现了小鼠全身透明化，PACT-PARS同时进行了脑部的共聚焦扫描成像，形象的展示了脑部神经元的结构，但是对于其他器官的研究仍然很表浅。不同组织的组成成份和结构不同，因此透明化条件略有差异，虽然CUBIC和PACT-PARS均实现了小鼠全身透明化，但两者的缺点均较明显：(1)CUBIC虽然透明化效果较好，但试剂组成复杂，且涉及到不常用试剂，其中的N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine(即EDTP)很粘稠，配液困难，且其透明化试剂包含两种，需要依次使用，每种试剂处理时间不同，操作步骤相对复杂，而且由于EDTP是一种铜离子沉降剂，不能用常规的BCA法进行蛋白定量，同时，由于CUBIC-1较为粘稠，用Nanodrop进行蛋白定量也不准确；(2)8％SDS虽然简单，但是透明化效果较差，且组织肿胀严重，蛋白损失较多。
技术实现思路
为了解决现有技术中的透明化液透明化效果差，蛋白质损失较大等技术弊端，本专利技术实施例提供如下技术方案。作为本专利技术的一个方面，涉及一种组织透明化液SUT，该组织透明化液SUT主要由SDS(SodiumDodecylSulfate)和Urea及TritonX-100构成。具体来讲，该组织透明化液SUT中，SDS、Urea和TritonX-100的浓度用量为：4％≤SDS(wt/vol)≤12％，15％＜Urea(wt/vol)≤40％，10％≤TritonX-100(vol/vol)≤20％。作为优选，该组织透明化液SUT中，SDS、Urea和TritonX-100的浓度用量为：8％SDS(wt/vol)，25％Urea(wt/vol)，15％TritonX-100(vol/vol)。作为本专利技术的另一个方面，涉及上述组织透明化液SUT的制备方法，称取固态SDS(十二烷基硫酸钠)4～12克，Urea(尿素)15～40克于玻璃瓶中，加入适量0.1MPBS(也可用蒸馏水或生理盐水等代替)(少于80ml)，搅拌混匀，待两者溶解后，加入液态TritonX-10010～20毫升，加热搅拌均匀，再用0.1MPBS(也可用蒸馏水或生理盐水等代替)定容至100ml，搅拌均匀即可。作为本专利技术的再一个方面，涉及上述组织透明化液SUT在组织透明化中的应用。具体来讲，涉及上述组织透明化液SUT在心脏组织透明化中的应用。本专利技术实施例提供的组织透明化液SUT至少具有如下优点：降低了透明化液配制的成本及难度，增加了透明化效果，其对心肌的透明化程度优于部分现有透明化液配方(图2a)；和PACT-PARS的透明化液8％SDS相比，组织透明化过程中蛋白丢失量更少(图2b)，更大程度的保留了组织的分子结构；在得到更佳的组织透明度的同时，尽量保持了组织的原有形态，减轻了组织体积肿胀并减少了组织质量的增加(图2c，图3)；在较短时间内(3—6天)实现了小鼠(ICR/CD-1小鼠，10周)左室全层的被动透明，同时，仅用时3天便完成了小鼠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组织透明化液SUT，其特征在于，所述组织透明化液SUT主要由SDS和尿素及TritonX‑100构成。
【技术特征摘要】
1.一种组织透明化液SUT，其特征在于，所述组织透明化液SUT主要由SDS和尿素及TritonX-100构成。2.如权利要求1所述的组织透明化液SUT，其特征在于，所述组织透明化液SUT中，SDS、Urea和TritonX-100的浓度用量为：4％≤SDS(wt/vol)≤12％，15％＜尿素(wt/vol)≤40％，10％≤TritonX-100(vol/vol)≤20％。3.如权利要求2所述的组织透明化液SUT，其特征在于，所述组织透明化液SUT中，SDS、Urea和TritonX-100的浓度用量为：8％SDS(wt/vol)，20-30％尿素(wt/vol)，15％TritonX-100(vol/vol)。4.如权利要求3所述的组织透明化液SUT，其特征在于，所述组织透明化液SUT中，SDS、Urea和TritonX-100的浓度用量为：8％SDS(wt/vol)，25％尿素(wt/vol)，15％TritonX-10...
【专利技术属性】
技术研发人员：王志伟，王巍，张杰，范桄溥，闫宇鹏，
申请(专利权)人：王志伟，
类型：发明
国别省市：北京,11
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