本发明专利技术属于动物细菌基因工程领域，具体涉及一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清７型双基因缺失突变株的构建、疫苗及应用。本发明专利技术得到一株区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清７型基因缺失突变株ＡＰＰ－７－ｍｕｔ０１（保藏号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０７００４）。该株缺失ＡＰＰ血清７型两个主要的毒力因子ａｐｘⅡＣ和ａｐｘⅣ ＡＮ基因。突变株对猪安全，且具良好免疫原性的毒素ＡｐｘⅡＡ和ＡｐｘⅣ ＡＣ蛋白，保证了疫苗的免疫效力。用突变株的疫苗免疫动物，动物体内不再产生针对Ａｐｘ ⅣＡＮ蛋白抗体，而野毒猪感染的产生针对ＡｐｘⅣＡＮ蛋白抗体。本发明专利技术还公开了利用该双基因缺失突变株构建，疫苗制备及应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物细菌基因工程
，具,及一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放 线杆菌血清7型基因缺失突变株的构建、疫苗制备及应用，背录技术猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneum0nia POP)是由胸膜肺炎放线杆菌 Uc"'加6aw'2J"si^euro/ 加,fae, APP〉弓跑的一种猪传染性呼吸離病，给世界养猪业造成了严重 的经济损失，自我国发现PCP流行以来，广大兽医工作者对其病原学、流行病学、诊断及防制等方面都进 行了一系列研究，取得了一定的成就，但目前该病在我国发病率仍逐年增长，有的猪场阳性率已达到70 %以上，已经成为集约化猪场的主要传染病之一，严重危及到我国的养猪业.APP是一种革兰氏阴性菌，分为2个生物型,共15种血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Apx)、 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、荚膜多糖(Capsular Polysaccharide, CP〉、外膜蛋fi (Outer Me迈brane Protein, (MP)、尿素酶(Urease)等，但大量研究证实，溶血外毒素(Apx)是其主要毒力因子，同 时也是很好的免疫保护性抗原，APP共产生四种不同的溶血外毒素，即Apxl、 ApxII、 Apx迈和 ApxlV。不同的血清型产生的外毒素不同，除ApxW外没有任何一种血清型APP能同时产生ApxI 、 ApxH、 Apx迈三种毒素。各种血清型APP所产生毒素种类见表1。_表1: A讽毒素在不同APP血清型中的分布_毒素类型 APP血清型Apx I1591011ApxII123456 789111215*ApxIII2346815'ApxIVA123456 78910111215**注血清型15是JKfi提出的(Blackall，etal.2002):血清型13、 14所含的Apx尚不十分清楚,但 已证实其存在ApxWA(Bosse， et a1.2002)。目前在APP中已发现4种不同的Apx具有溶血活性或细胞毒性,即ApxI、ApxII、ApxI11和ApxIV(Frey 等.Actinobacillus pleuropne咖oniae OTX-toxins: uniform designation of ha棚olysins, cytolysins, pleurotoxin and their genes. J Gen Microbiol, 1993, 139(Pt 8): 1723-1728; Schaller A等. Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of A;"加6aci7细/j/earo/meuffloniae. 裕croAiWo肪1999, 8 ( Pt 8): 2105-2116),如果要产生和分泌具有生物活性的Apx毒素，需要相邻 的按一定顺序排列的四个基因CABD组成的操纵子调控，其中A基因编码毒素结构蛋白，C基因编码毒素激 活蛋白，负责对毒素进行酰基化旨，B基因和D基因的翻译后蛋白产物形成跨膜通道，负责毒素由细胞 内到细胞外的分泌。Apxl、 ApxIIl操纵子有完整的CABD基因，而ApxII操纵子只有C基因和A基因，其 产物由Apxl的抑基因产物负责分泌到细胞外，通过对APP其它毒力基因的缺失或插入失活，人ff;i对一些毒力因子的结构、功能、免疫学意义有一定 程度的了解，并获得了一系列有应用前禁的突变株，动物实验结果表明毒力基因缺失的突变株能诱导动物产生针对不同血清型APP攻击的交叉保护，展示了APP突变株制备的基因缺失疫苗良好的应用前景，同 时也提示通M^毒力因子的深入研究，是大有希望获得广谱、安全、髙效的APP基因工程疫苗的，Apxl、 ApxII具有溶血活性,ApxI溶血活性强于ApxII,ApxIII没有溶血活性但有很强的细胞毒性。ApxI、 ApxII、 ApxIII三种毒素对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的，这三种毒素在 体内外都能表达，对肺巨噬细胞、多形核白细胞、肺上皮细胞和内皮细胞都有不同程度的细胞毒 性，除ApxII只含有ApxIICA基因外，Apxl和Apxin均包括Apx CA抑4个基因。其中A基因编码毒 素的结构蛋白，C基因编码毒素激活蛋白，激活A蛋白与靶细胞结合并发挥毒素活性，B和D基因产物为 毒素分泌时所必需,在不分泌毒素Apxl的APP中同样有即xl抑基因存在,而抑xIICA的分泌是在Apxl邸 的作用F完成的，在研究中人们还发现，编码毒素激活因子的C基因缺失或失活可导3lCA蛋白丧失溶血活性，从而使其毒 力显著下降，但不具有溶組活性的A蛋白仍保持良好的免疫原性，此外，人们在临床上还观察到，曾经感 染APP存活的猪获得了对所有血清型菌株再次感染的免疫力，其可能原因在于一方面细菌诱导的呼吸道 局部粘膜免疫反应发挥了交叉保护作用，这种局部免疫反应是常规疫苗经肌肉注射免疫时所不能达到的； 另一方面，交叉保护力的产生还可能与定居在呼吸道局部的APP在繁殖过程中合成或分泌的其它物质刺激 机体产生了广泛而完整的免疫应答，受这种现象的启发以及对A讽结构与功能的不断了解，国外学者构建 了ApxnC基因插入失活的基因工程突变株，经鼻腔内接种动物，不仅表现出毒力降低，而且能诱导动物产 生针对不同血清型APP攻击的交叉保护,展示了APP基因缺失疫苗良好的应用前景(Prideaux C T等， Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of Actinobacillus pleurop朋咖oniae produced by site-specific mutagenesis of the ApxII operon. Infect Inmun, 1999, 67 (4): l恥2-l恥6)。申谙人所在的华中农业大学动物传染病研究室也按同样的方 法构建了以我国地方分离的APP血清7型菌株为亲本菌株(HB04)的印xIIC基因描入失活的基因工程突变 株，并进一歩构建了即rflC单基两缺失的疫亩株冊04C (apxIIC ),免疫实验动物证实具有很好的免疫效 果(贝为成(Bei ，)等.Construction and characterization of a live, attenuated apxIICA inactivation 咖tant of Actinobacillus pleuropne咖oniae lacking a drug resistance marker. F鹏Microbiol Letter. 2005, 243: 21-27)1997年Anderson和ltectones首先发现毒素A讽IV,它在结构上与其他的三种Kn毒素有相似处， 也有独特处，特性上更有许多独特的鲜为人知的地方。apxIVA基因是位于APP LacZ基因上游的一Slt似 于RTX毒素家族成员脑膜炎奈瑟球菌铁调控外分泌蛋白FrpA和ErpC基因的序判本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种区分疫苗免疫和野毒感染动物的猪胸膜肺炎放线杆菌血清７型双基因缺失突变株，其特征在于，该菌株是猪胸膜肺炎放线杆菌Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＰＰ－７－ｍｕｔ０１，其保藏号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０７００４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贝为成，陈焕春，刘金林，周锐，何启盖，金梅林，方六荣，吴斌，肖少波，曹胜波，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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