减少烟草中的烟草特异性亚硝胺NNK的方法和组合物技术

本发明专利技术提供包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁降解酶的核苷酸序列。本文还提供用于生产具有减少的假氧尼古丁(PON)和/或4‑(甲基亚硝基氨基)‑1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁酮(NNK)含量的烟草植物和烟草产品的方法和组合物。

Methods and compositions for reducing tobacco specific nitrosamines NNK in tobacco

The invention provides tobacco plants, plant parts and / or plant cells containing one or more heterologous nucleic acid molecules, and the nucleic acid molecules contain nucleotide sequences encoding fake oxygen nicotine degrading enzymes. This paper also provides for the production of oxygen reduction with false nicotine (PON) and / or 4 (methyl - amino) 1 (3 pyridyl) 1 ketone (NNK) method and the composition content of the tobacco plant and tobacco products.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】减少烟草中的烟草特异性亚硝胺NNK的方法和组合物优先权声明本申请依据35U.S,C,§119(e)，要求2015年5月5日提交的美国临时申请号62/156,981的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。关于序列表的电子提交的声明依据37C.F.R.§1.821提交的ASCII文本格式的序列表(题名为5051-880WOST25.txt,大小30,014字节，2016年5月3日生成并经由EFS-Web提交)，被提供以代替纸副本。该序列表通过引用，以其公开内容结合到本说明书中。专利
本专利技术涉及假氧尼古丁降解酶和它们在烟草及其产品中减少烟草特异性亚硝胺的用途。专利技术背景烟草特异性亚硝胺(TSNA)是通过烟草生物碱的亚硝化作用产生的一类化合物。TSNA的水平在新鲜收获的烟草植物中是非常低的，然而在随后的叶的熟化和处理期间显著地增加(Bushetal.Rec.Adv.Tob.Sci.27:23-46(2001))。在熟烟草叶中发现的4种主要的TSNA是N’-亚硝基降烟碱(NNN)、N’-亚硝基新烟草碱(NAT)、N’-亚硝基假木贼碱(NAB)和4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。TSNA的重要性源于它们涉及烟草-相关的癌症。特别地，NNK和NNN被认为是在烟草产品中发现的最强的致癌物(Hecht,S.S.Chem.Res.Toxicol.11:559-603(1998);Hecht,S.S.Nat.Rev.Cancer3:733-744(2003);Hecht,S.S.LangenbecksArch.Surg.391:603-613(2006);Hoffmannetal.,J.Toxicol.Environ.Health41:1-52(1994))并已由国际癌症研究机构(InternationalAgencyforResearchonCancer)(IARC,2007)分类为1类致癌物(最强的类别)。相比之下，NAT和NAB似乎是弱致癌的或者良性的。虽然已表明NNN是动物系统中的强烈致癌物，与食管及口腔和鼻腔的癌症高度相关，但NNK可论证地是最成问题的TSNA。在动物系统中的许多致癌性研究，与吸烟者的流行病学数据和组织和体液的生物化学评估结合，导致研究者得出结论，NNK是烟草-相关的肺癌的主要的决定因素(Hecht,S.S.Chem.Res.Toxicol.11:559-603(1998);Hecht,S.S.Nat.Rev.Cancer3:733-744(2003);Hecht,S.S.LangenbecksArch.Surg.391:603-613(2006))。在每一种测试的动物物种中，已显示NNK引起肺瘤，而不管其给予途径。NNK也可能涉及吸烟者和类似的无烟产品的用户的口腔和鼻腔的癌症，以及肝、胰和子宫颈的癌症。当氧化氮种类(如NO、NO2、N2O3和N2O4)与烟草生物碱反应时形成TSNA(图1)。NAT和NAB分别经由二级生物碱新烟草碱和假木贼碱的亚硝化作用形成。虽然早期研究认为NNN源自尼古丁和降烟碱二者(Hechtetal.J.Natl.CancerInst.60:819-824(1978))，更加晚近的报告已证实，在熟烟草叶中NNN的出现与降烟碱含量确实相关，而不是与尼古丁相关(Bushetal.,Rec.Adv.Tob.Sci.27:23-46(2001);Lewisetal.PlantBiotech.J.6:346-354(2008))。NNK形成的前体/产物关系是不甚清除的。优势文献简单地叙述了NNK是尼古丁的亚硝化产物(如，Hoffmannetal.,J.Toxicol.Environ.Health41:1-52(1994);Hecht,S.S.Chem.Res.Toxicol.11:559-603(1998))。这个结论主要基于尼古丁在低pH的水性环境中的亚硝化特性的体外观察(Caldwelletal.,Chem.Res.Toxicol.4:513-516(1991))。作为在其吡咯烷环上具有保护性甲基的叔生物碱，然而，尼古丁对亚硝化作用比二级生物碱降烟碱、新烟草碱和假木贼碱(在它们的非-吡啶环上缺乏类似的保护性基团)更不易受影响(图1)。由于尼古丁亚硝化的缓慢的反应速率，很可能是尼古丁的氧化衍生物，而不是尼古丁本身作为NNK的直接前体起作用(Caldwelletal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.686:213-228(1993))。由于广泛可接受的假设，即TSNA明显地对烟草-相关的癌症负有责任，减少它们在烟草产品中的流行率的方法已进行深入调查。理论上，在烟草产品中发现的任何TSNA水平可通过其生物碱前体的有针对性的减少，或者通过减少对涉及的亚硝化试剂的暴露来降低。在更引人注目的成就中，落入后一类的包括：(1)，具有热交换器的烤房的改良，以在叶烤干期间减少导致TSNA形成的氧化亚氮气体(Hamm,L.A.Rec.Adv.Tob.Sci.27:13-15(2001);Peeleetal.Rec.Adv.Tob.Sci.27:3-12(2001))；和(2)，采用巴氏灭菌方法以杀灭烟草叶上的产亚硝酸盐的微生物，所述烟草叶用于生产称为“snus”的低-TSNA无烟产品。通过有针对性的减少生物碱前体来减少TNSA的最佳实例涉及旨在降低熟烟草叶中NNN含量的最近的努力。通过敲除负责合成生物碱降烟碱的基因功能，证实在风干的白肋(burley)烟草中的降烟碱和NNN水平与使用现有的商业品种和生产实践而获得的水平比较可减少约80%(Lewisetal.PlantBiotech.J.6:346-354(2008);Lewisetal.Phytochemistry71:1988-1998(2010))。虽然在过去二十年中，在降低熟烟草叶内形成和积累的TNSA的量方面取得显著的进展，事实是在大多数商业烟草产品中发现的NNK和NNN的量，比其它消费品，例如腊肉、啤酒和其它食物中发现的致癌物亚硝胺的水平仍高数百至数千倍(Bartsch和Spiegelhalder,Eur.J.Can.Prevent.5,11-18(1996);Hechtetal.,Tob.Control20,443(2011);Hotchkiss,J.H.CancerSurv.8:295-321(1989))。因此，对设计可进一步减少烟草植物和从烟草植物生产的产品中的TNSA，特别是NNK水平的方法，仍存在大量需求。专利技术概述在一个方面，本专利技术提供包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列。在某些方面，编码PON降解酶的核苷酸序列可在烟草中优化表达。在另外的方面，PON降解酶可融合(即，可操作地连接)于液泡靶向序列或内质网靶向信号序列。在特别的方面，PON降解酶是假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)。在进一步的方面，本专利技术提供减少烟草植物的PON和/或NNK的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞中。在更进一步的方面，提供生产具有减少的PON和/或N本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.05 US 62/1569811.包含一种或多种异源性核酸分子的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，所述核酸分子包含编码假氧尼古丁(PON)降解酶的核苷酸序列。2.权利要求1的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PON降解酶来自已知降解尼古丁的真菌或细菌属。3.权利要求1或权利要求2的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PON降解酶是假氧尼古丁胺氧化酶(PAO)。4.权利要求3的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中PAO来自假单胞菌(Pseudomonas)菌株HZN6或恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)S16。5.权利要求3或权利要求4的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中编码PAO的核苷酸序列包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核苷酸序列。6.权利要求3-5的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中编码PAO的核苷酸序列编码包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽。7.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至液泡靶向序列。8.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中由所述核苷酸序列编码的PON降解酶融合至内质网(ER)靶向信号序列。9.权利要求1-6的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其包含至少两种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子，其中所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至液泡靶向序列的PON降解酶的核苷酸序列，并且所述至少两种异源性核酸分子中的至少一种包含编码融合至ER靶向信号序列的PON降解酶的核苷酸序列。10.权利要求7或权利要求9的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中液泡靶向序列由SEQIDNO:8的核苷酸序列编码。11.权利要求7、9或10的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶由SEQIDNO:6的核苷酸序列编码。12.权利要求7、9或11的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中融合至液泡靶向序列的PON降解酶包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。13.权利要求1-12的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，其中核酸分子还包含一种或多种调节序列。14.从权利要求1-13的任一项的烟草植物、植物部分或植物细胞产生的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。15.来自权利要求14的后代植物的种子，其中所述种子包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。16.由权利要求14或权利要求15的种子产生的烟草植物，其中所述植物包含所述一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子。17.包含在农田中种植在一起的权利要求1-14或16的任一项的多种烟草植物的植物作物。18.从权利要求1-13的任一项的烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从权利要求14的后代植物，从权利要求14或15的种子，从权利要求16的植物，和/或从权利要求17的作物生产的烟草产品。19.权利要求18的烟草产品，其中烟草产品是烟叶、烟丝、生切烟丝、研磨烟丝、粉末烟草、烟草提取物、尼古丁提取物、无烟烟草、潮湿或干燥鼻烟、丁香烟、烟斗烟草、雪茄烟草、小雪茄烟烟草、卷烟用烟叶、嚼用烟草、比迪烟、bits和含烟草的口香糖、糖锭片、贴片、电子香烟，或其任何组合。20.权利要求18的烟草产品，其中烟草产品是香烟、小雪茄烟、非透气休闲过滤香烟、透气休闲过滤香烟、雪茄、鼻烟、嚼用烟草或其任何组合。21.权利要求18-20的任一项的烟草产品，其中产品具有减少量的PON和/或NNK。22.一种在烟草植物、植物部分和/或植物细胞中减少假氧尼古丁(PON)和/或4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的方法，其包括：将一种或多种含有编码PON降解酶的核苷酸序列的异源性核酸分子引入烟草植物、植物部分和/或植物细胞，从而减少转基因烟草植物和/或植物部分中的PON和/或NNK含量。23.一种生产具有减少的假氧尼古丁(PON)和/或4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)含量的植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：RE德维，RS刘易斯，
申请(专利权)人：北卡罗莱纳州立大学，
类型：发明
国别省市：美国,US