家蚕丝腺生物工厂的建立方法及其制药用途技术

本发明专利技术公开了一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，以转座子ｐｉｇｇｙＢＡＣ因子为基础载体，通过基因工程操作构建带有家蚕丝蛋白特异性启动子控制外源基因表达盒、增强子活性的元件、抗生素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕连续添食特定抗生素至４龄眠，获得抗特定抗生素、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。利用该转基因家蚕的丝腺组织可获得药用蛋白药物。本发明专利技术方法实现转基因家蚕丝腺工厂制备药用蛋白药物，生产成本低，不涉及具有潜在危害的杆状病毒，安全性高，具有重要的实施价值。

【技术实现步骤摘要】
家蚕丝腺生物工厂的建立方法及其制药用途
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种家蚕丝腺工厂的建立方法及 其在多肽类药物制备领域的用途。
技术介绍
生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃 发展。转基因动物生产的蛋白经过后加工而类似人体天然蛋白的结构，有完全 相似的生物活性，用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物
里的 又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。转基因动物生物反应器生产药用蛋白的一种技术路线是，将目的基因构建 成载体，通过不同方法获得转基因动物，通过转基因动物的特定器官收集并提 纯药用蛋白，目前以乳腺生物反应器较为多见，已成功地在转基因动物的乳腺 生物反应器中表达了多种蛋白基因。家蚕是一个理想的生物反应器，具有表达水平髙、翻译后加工与修饰、安 全性髙、成本低廉等优势，已经成为某些真核生物所不可替代的表达系统。家 蚕丝腺是典型的外分泌腺体。它是由功能高度特化为合成、分泌丝蛋白的巨核 细胞所构成的单层细胞管壁的管状器官。丝腺合成并分泌到丝腺腔里的蛋白共 两类，即丝素蛋白与丝胶蛋白。丝素蛋白在后部丝腺合成，有重链、轻链和P25 三种蛋白分子以6:6:1的比例构成，难溶于水(Cong-Zhao Zhou, et al. Nucleic Acids Reasearch， 2000， 28(12):2413-2419;Inoue S, et al. J Biol Chem, 2000， 275(51):40517-28)。由于丝腺具有强大的生产蛋白质和分泌蛋白质的能力，而 且丝腺腔中只含有丝素蛋白和丝胶蛋白，其性质比较特殊，很容易与其他目的 蛋白质分开，将对后分离纯化带来极大方便，这一优点将是已有的表达系统所 不及的。因此，利用家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源髙价值蛋白具 有实用经济效益和广阔的发展前景。公开号为CN1786176的中国专利《家蚕丝腺生物反应器及其构建方法》公开了一种家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应 器，通过构建由含有丝胶-l基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目 的基因、含有丝胶-1基因polyA信号位点序列的表达框构成的丝腺特异分泌 表达质粒，再将表达框架亚克隆进病毒表达系统的供体质粒，然后转化 DH10BacAEGT感受态细胞，抽提重组病毒DNA,导入载体细胞包装成重组 病毒质粒，大量扩增病毒，最后注射家蚕，当病毒在蚕体大量繁殖，复制的时 候，外源基因在启动子的控制下得到表达和后加工。上述现有技术的特点是利用昆虫病毒表达系统表达外源基因，该系统的缺 点是存在病毒的潜在危害。公开号为CN1912116的中国专利，利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表 达外源蛋白的方法公开了一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋 白的方法，以piggyBac的衍生载体pBac[3xp3-DsRedaf为转座子，构建携带 IGF-I基因且可进行表达的重组注射载体pBac[3XP3-DsRedaf-R3，经 QIAGEN Plasmid Midikit ( Qiagen )试剂盒纯化，与pHA3PIG ( Tamura et al.， 2000)辅助质粒一起，采用Kanda & Tamura (1991)描述的方法进行家蚕胚 胎显微注射。注射后的蚕卵用无毒胶封口，催青孵化，将当代的蚕蛾进行自交 或回交，获得G1代蚕卵，扫描Gl代蚕卵获得转基因个体。该专利所公开的方法中没有使用病毒表达系统，所以不存在杆状病毒可能 带来的问题。piggyBAC因子又称IFP2，是目前应用比较广泛的昆虫转座子，已被证实 在多种昆虫中可以发挥转座作用，可以通过转座而将外源基因重组整合到昆虫 基因组中。通常情况下，通过抗生素压力筛选可以获得稳定表达外源基因的转基因个 体。运用G418筛选哺乳动物转化细胞已有较多的报道，而通过稳定转化的昆 虫细胞表达外源基因的报道还不多见，而通过G418筛选转基因家蚕个体研究 更少。最近，Invitrogen公司开发了一种能在昆虫sf细胞稳定表达外源基因 的载体pIZT/V5-His，该载体通过Zeocin的抗性标记筛选可获得稳定表达外源 基因的细胞系，而通过Zeocin抗生素对转基因家蚕的筛选方法也未见报道。鉴于家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源髙价值蛋白具有实用经济效益和广阔的发展前景，研发一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法具有重要的意 义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，在丝腺组织特异性 表达外源蛋白，以避免采用杆状病毒载体可能带来的问题。本专利技术进一步的目的是提供含有表达的外源蛋白的药物的制备方法，以简 化工艺，降低制备成本。为达到上述目的，本专利技术釆用的技术方案是一种家蚕丝腺生物工厂的建 立方法，包括以下步骤(l)构建带有家蚕丝腺特异性表达基因的启动子X控制外源蛋白基因表达(2) 构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有荧光蛋白报告 基因的载体pigA3-en;(3) 双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同 样双酶切的pigA3-en,得带有增强子en和启动子控制外源基因的载体；(4) 构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制抗生素抗性基因的重组载体；(5) 酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制抗生素抗性基因的片段，克隆 进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有启动子X控制外源基因表达盒、增 强子元件、抗生素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体；(6) 步骤(5)所得重组转基因载体，在辅助质粒的作用下，利用精子介导法导 入初产卵，孵化，筛选获得带有抗生素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕， 检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。上述技术方案中，所述家蚕丝腺特异性表达基因启动子X选自丝素蛋白 重链基因启动子、丝素蛋白轻链基因启动子、丝胶蛋白-1基因启动子或户25 基因启动子中的一种。所述外源蛋白基因可以是药用蛋白基因，如人胰岛素样 生长因子-I (/C7F-I)基因、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h(7M-C^F) 基因；也可以是抗原蛋白基因。所述的增强子w选自家蚕丝素蛋白轻链基因 第一内含子序列、杆状病毒的同源区(homologous region)增强子序列中的一种。所述昆虫细胞内具有活性的启动子Y为家蚕核型多角体病毒基因 启动子。所述的荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因中的一种。所述的抗性基因可以为新霉素抗性基因A/。上述技术方案中的步骤(6)中所述的精子介导法是一种常用的向蚕卵导入 外源基因的方法，本专利技术中的家蚕品种为菁松品种，正常饲养至化蛾，将步骤 (5)所得的转基因载体与辅助质粒混合，用毛细管注入处女蛾交尾襄，正常交配， 产卵。步骤(6)中所述的筛选方法是抗生素筛选与荧光检测结合，具体步骤为 孵化步骤(6)所得的初产卵，孵化后的蚁蚕(G0)连续添食特定抗生素，G418 或者Zeodn至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出具有抗性基因、荧 光蛋白报告基因的家蚕。抗生素G418的作用不仅仅是筛选，还可以防止所导 入家蚕基因组的外源基因在继代过程中丢失。上述技术方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　（１）构建带有家蚕丝腺特异性表达基因的启动子Ｘ控制外源蛋白基因表达盒；　　　　（２）构建带有增强子元件ｅｎ的基于ｐｉｇｇｙＢＡＣ转座子的带有荧光蛋白报告基因的载体ｐｉｇＡ３－ｅｎ；　　　　（３）双酶切步骤（１）所得载体，回收启动子Ｘ控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的ｐｉｇＡ３－ｅｎ，得带有增强子ｅｎ和启动子Ｘ控制外源基因的载体；　　　　（４）构建昆虫细胞内具有活性的启动子Ｙ控制抗生素抗性基因的重组载体；　　　　（５）酶切步骤（４）所得载体，回收启动子Ｙ控制抗性基因的片段，克隆进同样酶切的步骤（３）所得载体，得到带有荧光蛋白报告基因和启动子Ｘ控制外源基因表达盒、增强子元件、启动子Ｙ控制抗生素抗性基因的重组转基因载体；　　　　（６）步骤（５）所得重组转基因载体，在辅助质粒的作用下，利用精子介导法导入初产卵，孵化，筛选获得带有抗生素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。

【技术特征摘要】
1. 一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于包括以下步骤(1)构建带有家蚕丝腺特异性表达基因的启动子X控制外源蛋白基因表达盒；(2)构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有荧光蛋白报告基因的载体pigA3-en；(3)双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的pigA3-en，得带有增强子en和启动子X控制外源基因的载体；(4)构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制抗生素抗性基因的重组载体；(5)酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制抗性基因的片段，克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有荧光蛋白报告基因和启动子X控制外源基因表达盒、增强子元件、启动子Y控制抗生素抗性基因的重组转基因载体；(6)步骤(5)所得重组转基因载体，在辅助质粒的作用下，利用精子介导法导入初产卵，孵化，筛选获得带有抗生素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。2. 根据权利要求1所述的构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，曹广力，薛仁宇，沈卫德，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]