本发明专利技术公开了一种拟南芥ｍｉＲ３９６小分子的用途。本发明专利技术涉及利用拟南芥ｍｉＲ３９６小分子提高植物抗干旱能力，并提供了切实可行的应用方法。所述方法包括制备拟南芥ｍｉＲ３９６小分子前体；构建了相应的植物表达融合质粒，转化相应的农杆菌；利用重组农杆菌介导拟南芥小分子前体的转化，将ｍｉＲ３９６小分子前体导入拟南芥获得相应的转基因植株；然后进行相应的拟南芥转基因植物的耐干旱能力评估。本发明专利技术提供了拟南芥ｍｉＲ３９６小分子培育具有耐干旱能力的农作物、园艺植物和牧草新品种的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以转墓因植物技术为主的农业生物技术，更具体地说，本发 明涉及利用拟南芥miR396小分子提高植物抗干旱能力。
技术介绍
自从2002年被Science评为当年十大科技突破的第 一名以来， MicroRNAs (miRNAs)成为当今生物学研究的热点之一。miRNAs是由具有发 夹结构的单链RNA前体(约70 ~ 90个碱基大小)经过Dicer酶加工后生成 的具有调控功能的且大小约21个碱基的小分子RNA(Bartel andBartel, 2003; Bartel2004)。 miRNAs的一个共同特点，就是它的序列存在于茎环结构的茎 上(Jones-Rhoades and Bartel, 2004)。这种茎环结构通常是由70多个核苷酸 组成的不完全的发夹结构，上面有一些凸起和环状结构。茎部形成双链RNA, 但不是严格互补，可存在错配和摆动配对(Lau W a/., 2001; Lee and Ambros, 200Reinhart W a/., 2002)。miRNAs调控基因表达的三个基本机制剪切、翻译抑制、转录后沉默 (Jones-Rhoadese"/.,2006)，其中剪切机制是最容易理解的一种模式。在植 物中，大多数的miRNAs通过剪切来介导其靶基因的降解(Jones-Rhoades " 2006)。例如，miR196介导其靶基因ifoA;6S的mRNA剪切(Yekta " a/.， 2004)。植物中的miRNAs与相应的靶基因近似完全配对，并且互补区域散 布在靶基因mRNA的转录区域内而非仅仅局限在3，-UTR,使得miRNAs会结 合到包括编码区域在内的多位点'上去，从而直接降解mRNA而非抑制其翻 译。但是miR172是一个特例，它在拟南芥花发育中介导翻译抑制(Chen2004; Jones腸Rhoades a/., 2006)。Sunkar和Zhu于2004年构建了拟南芥幼苗的干單、盐碱、低温、脱落酸 胁迫的小分子RNA文库。他们的Northem杂交分析表明，干旱、盐碱、低温 胁迫或脱落酸(ABA)处理可诱导miRNAs基因的表达。Zhang等于2005年用 EST序列分析技术发现123种受逆境胁迫诱导的含miRNAs序列的EST基因簇 (contigs)。其中有36种EST基因簇与微生物感染有关，25种与温度胁迫有关， 28种与干單胁迫有关(Zhang "a/" 2006)。有研究发现miRNAs在植物病毒侵染植物的过程中也起作用。表现在病 毒通过miRNA指导切割多种调控性靶基因来干扰宿主细胞的基因表达方 面(Kasschau W 2003; Chellappan ""/ ， 2005),又表现在植物miRNAs通过 切割病毒基因抑制病毒侵染方面(Llave, 2004)，这对提高植物抗病性的研究 有重大指导意义。miR396是Jones-Rhoades等人于2004年通过生物信息学方法发现的。他 们通过PCR、 Northem杂交及5，-RACE等实验方法验证了miR396的存在和表 达，即miR396基因在拟南芥中有两个位点，分别存在于2号染色体和5号染 色体上。同时预测了 miR396可能的靶基因为GWwA及egw/a"o" Fbcto Y^G7^, Rhodenase-like protein和Kine,sin-like protein B, 并通过 5'-RACE验证了部分AGi F基因家族成员(^G/ F/、 AG/ F2 、 AG/ F3 、 力G7 F7、 AG7 T^、 AG7 F"是miR396的靶基因(Jones-Rhoades and Battel, 2004; Jones-Rhoades et al., 2006)。通过EST序列分析方法发现miR396在15个 不同的物种中存在，是高度保守的小分子，并且其初始转录体和成熟的 miRNA都是高度保守的，特别是成熟miRNA序列及其互补序列，这暗示 miR396可能在植物发育方面具有重要且保守的功能(Zhang " a/., 2006)。虽然已经证实了部分^G7 F基因家族成员(^G/ F7、力G7 F2、 AG7tF3、 AG7 F7、 AGi2FS、 AGi^"是miR396的靶基因(Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Bonnet "a/., 2006; Jones-Rhoades "a/., 2006)。 但是，迄今为止，现 有技术中对拟南芥miR396小分子的功能并未阐明，关于拟南芥miR396小分子提高植物耐干旱能力的研究至今尚未见报导。无疑，这是一项值得深入研 究与探讨的课题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提出以下专利技术目的第一、揭示拟南芥miR396小分子的分子生物学功能及其应用； 第二、提供一种利用所述的拟南芥miR396小分子培育具有耐干旱能力 的农作物、园艺植物和牧草新品种的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。本专利技术提供了 miR396小分子在提高植物抗干單能力方面的新应用。 同时，本专利技术提供了拟南芥miR396小分子提高植物抗干旱能力的应用 方法，该方法采用以下步骤1. 利用本专利技术获得的拟南芥miR396小分子前体，构建了相应的植物表 达融合质粒，转化相应的农杆菌；2. 利用重组农杆菌介导拟南芥小分子前体的转化，将miR396小分子前 体导入拟南芥获得相应的转基因植株；3. 进行相应的拟南芥转基因植物的耐干旱能力评估。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果通过基因功能分析，揭示了拟南芥miR396小分子能显著提高植物耐干 單能力，具有广阔的应用前景。附图说明图1是miR396小分子前体的二级结构。图2是高表达miR396小分子转基因植株的筛选，其中A为miR396 高表达转基因植株叶片变窄(生长21天的拟南芥)；B为miR396高表达转 基因植株矮化(生长40天的拟南芥)；c为miR396及其前体在miR396高表达转基因植株和空载体对照中的表达。图3是转基因植株的耐旱性显著提高的效果图，其中:A为生长21天的miR396高表达转基因植株以及空载体在干旱处理前后和复水后的图片；B为存活率的统计。图4是转基因植株叶片细胞密度降低的比较图； 图5是转基因植株气孔密度降低的比较图。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，对本专利技术作进一步清楚地说明，但它们并 不是对本专利技术保护范围的限定。本领域的普通技术人员能从本专利技术公开的内 容直接导出的变形或者是等同的技术手段，均属于本专利技术的保护范围。实施例1一一miR396小分子的克隆miR396在拟南芥中有两个位点，分别存在于2号染色体和5号染色体上， 并且这两个位点都可以产生相应的miR396小分子，即miR396a和miR396b (它们只有一个碱基的差别)(Jones-Rhoades and Bartel, 2004)。采用PCR技 术，本专利技术从拟南芥基因组DNA之中扩增获得miR396a和miR396b前体序列， 然后克隆到pUCm-T Vector (Fermentas)。通过相关软件 (http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applicati本文档来自技高网...
【技术保护点】
拟南芥ｍｉＲ３９６小分子在提高植物抗干旱能力中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余迪求，刘冬梅，
申请(专利权)人：中国科学院西双版纳热带植物园，
类型：发明
国别省市：53[]
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