转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法技术

本发明专利技术涉及一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法。它经过抗真菌基因几丁质酶基因Ｃｈｉ和β－１，３－葡聚糖酶基因Ｇｌｕ的分离、克隆和双价表达载体的构建，以及非洲菊高效遗传转化再生体系的建立、抗真菌基因对非洲菊的转化等步骤，获得转基因植株。本发明专利技术以ＣａＭＶ３５Ｓ为启动子，将Ｃｈｉ、Ｇｌｕ、Ｎｐｔ　　Ⅱ在内的基因转化到切花非洲菊品种‘红帽子’中，获得了转基因植株，从而为获得大量的抗真菌病害的转基因非洲菊株系提供技术支持。该方法在有效提供抗真菌病害非洲菊转基因株系的同时，还将为非洲菊基因工程育种提供一条快速、有效、稳定的技术路径。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步骤：　　　　步骤１，以菜豆、烟草为试材进行Ｃｈｉ基因及Ｇｌｕ基因的分离、克隆及表达载体的构建：　　　　（１）基因分离与克隆　　　　Ａ、Ｃｈｉ基因扩增引物：根据菜豆几丁质酶ｃＤＮＡ序列ＧｅｎＢａｎｋ　　Ｍ１３９６８设计引物如下：　　　　Ｐ↓［１］：５’ＧＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＡＡＴＴＣＡＣ３’　　　　Ｐ↓［２］：５’ＣＧＴＴＡＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴ３’　　　　Ｂ、Ｇｌｕ基因扩增引物：根据烟草葡聚糖酶ｃＤＮＡ序列ＧｅｎＢａｎｋ　　Ｘ５３６００设计引物如下：　　　　Ｐ↓［３］：５’ＡＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧ３’　　　　Ｐ↓［４］：５’ＣＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧ３’　　　　Ｃ、总ＲＮＡ的提取及ＰＣＲ产物扩增：分别从菜豆及烟草中提取总ＲＮＡ，经逆转录酶将ＲＮＡ逆转录ｃＤＮＡ，并利用逆转录的ｃＤＮＡ在下列反应体系中进行ＰＣＲ扩增，得所需的Ｐｃｒ产物：　　　　１０×Ｐｃｒ　　ｂｕｆｆｅｒ　　２．５ｕｌ　　　　ｄＮＴＰ（２．０ｍＭ）　　２ｕｌ　　　　ＭｇＣｌ↓［２］　　２ｕｌ　　　　Ｐｒｉｍｅｒｌ（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）　　１ｕｌ　　　　Ｐｒｉｍｅｒ２（１０ｐｍｏｌ／ｕｌ）　　１ｕｌ　　　　Ｔａｑ酶（１ｕｇ／ｕｌ）　　０．５ｕｌ　　　　ｃＤＮＡ（２５ｎｇ）　　２ｕｌ　　　　Ｈ↓［２］Ｏ　　１１ｕｌ　　　　Ｄ、对Ｐｃｒ产物补平：利用Ｋｌｅｎｏｗ片段对上述Ｐｃｒ产物进行补平反应，其反应体系为：　　　　Ｋｌｅｎｏｗ片段Ｂｕｆｆｅｒ　　１０ｕｌ　　　　Ｋｌｅｎｏｗ片段　　３ｕｌ　　　　２．５ｍＭ的ｄＮＴＰ　　１７ｕｌ　　　　Ｐｃｒ产物　　７０ｕｌ　　　　反应条件为：３７℃，１ｈ，得到末端补平ＤＮＡ产物；　　　　Ｅ、末端补平ＤＮＡ产物的去磷酸化：对上述末端补平ＤＮＡ产物进行去５’端去磷酸化反应后，回收补平ＤＮＡ产物及Ｔ－载体克隆后，获得克隆Ｃｈｉ／Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ及Ｇｌｕ／Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ；　　　　（２）表达载体的构建　　　　Ａ、ｐＢ－Ｃｈｉ、ｐＢ－Ｇｌｕ表达载体的构建：分别用Ｓａｌ　　Ⅰ酶切Ｃｈｉ／Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ和Ｇｌｕ／Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ，用Ｋｌｅｎｏｗ片段按步骤１－（１）－Ｄ的体系对其补平，再用Ｓａｃ　　Ⅰ酶切，１％的电泳检测，回收９５８ｂｐ和９４０ｂｐ的目的片段；同时用Ｓｍａ　　Ⅰ的酶切质粒ｐＢ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李涵，晏慧君，张婷，李绅崇，王继华，张颢，黎霞，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]