本发明专利技术涉及一种蛋白酶的提取纯化工艺，具体是从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法。所说的从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法是先从动物心肌中获得粗提液，再经盐析后，选用ＤＥＡＥ－Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＦＦ离子交换层析及蓝色琼脂糖凝胶ＦＦ三种层析介质，采用色谱法从猪心中分离和纯化高铁肌红蛋白还原酶。本发明专利技术方法具有产品纯度高，工艺简单、成本低等优点，既可填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白酶的提取纯化工艺，具体是从心肌中提取纯化高铁肌红蛋 白还原酶的方法。
技术介绍
肉色是肉食品生产的重要经济性状，被科学家和生产者、消费者共同关注，肉色 鲜红富有光泽表明肉品新鲜、质地优良，它与肌肉中的肌红蛋白(Mb)及其还原酶 体系(Reductase)密切相关。Mb在体内以三种形态存在，分别是脱氧肌红蛋白，呈 紫红色；氧合肌红蛋白(oxymyoglobin,Mb02)，呈鲜红色；二者都可被氧化成高铁 肌红蛋白(metmyoglobin，MetMb)，呈暗褐色。肌肉中存在着三者相互转换的氧化还 原系统，在酶的作用下相互转变，并维系动态平衡和稳定的肉色。肌肉离体后，随 着高铁肌红蛋白还原酶(MetMbR)活性的逐步丧失，肌肉颜色逐渐褐变，提示肌肉 被空气中杂菌污染和肌肉开始变质，或骨骼肌机能下降等。即使在体外(生鲜肉保藏期间)，利用自身MetMbR氧化还原酶体系的护色机制 可干预MetMb的生成，维系肌肉的新鲜度和良好的肉色，在一定时间内体现生鲜肉 肉品品质；MetMbR高转换活性意味着心肌和骨骼肌具有良好携氧功能等。因此，研究MetMbR与MetMb相互作用关系，就需要得到比较理想MetMbR生 物材料作为基准物，才能提高研究的科学性、可靠性等。然而，理想和纯化的MetMbR 生物材料难以制备，这方面的实验条件研究进展缓慢，市场上亦无MetMbR生物制 品出现。若能够获得纯品的MetMbR,将为肉品学、运动医学和心血管疾病的研究 提供实验条件及材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法，该方法选用DEAE-Fast Flow、 CM-Sephadex FF离子交换层析及蓝色琼脂糖凝胶FF三种层析介质，采用色谱法从猪心中分离和纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法，可在较短的时间内得到电泳纯的高铁肌红蛋白，且得率高，有效地解决了问题。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是一种，包括以下步骤1) 将新鲜猪心肌剁碎，加水匀浆处理，粗匀浆用2NNH40H把pH调至7.5，静 置离心、过滤后得粗提液；2) 粗提液经40%-70%硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液重悬，离心后取上 清液对平衡缓冲液透析，透析膜的截留分子量为14 000，得透析液；所说的平衡缓 冲液是0.02M、 pH6.0磷酸盐缓冲液；3) 将透析液上样到缓冲液A平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析 柱，用缓冲液A冼脱杂蛋白，再缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集合并酶活 性部分，浓縮透析所说的缓冲液A是0.002M、 pH7.0、含0.001 M EDTA磷酸盐 缓冲液；缓冲液B是0.2M 、 pH7.0，含0.001 M EDTA磷酸盐缓冲液；4) 将得到的透析液上样到缓冲液C平衡过夜的CM-Sephadex Fast Flow阳离子 交换层析柱；用缓冲液C洗脱杂蛋白，洗脱完后，用缓冲液D洗脱，收集合并酶活性 部分，透析浓縮所说的缓冲液C是0.02M、 pH6.0磷酸盐缓冲液，所说的缓冲液 D是0.2M、 pH6.0磷酸盐缓冲液；5) 将具有酶活组分的透析液冷冻干燥后，上样到用缓冲液E平衡的蓝色琼脂糖 凝胶FF亲和层析，用缓冲液E洗脱杂蛋白，最后用缓冲液E和含l.OMNaCl缓冲液 E进行线性线性梯度，收集具有酶活性组分的洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白还 原酶所说的缓冲液E是0.03M、 pH6.0，含0.001MEDTA磷酸盐缓冲液。为了便于保存，还可将上述得到的高铁肌红蛋白还原酶液经透析、冷冻干燥后， -S(TC分装保存。与通常的蛋白酶提取纯化相似，其中第2 5步最好在4'C下进行。 本专利技术方法中所说的动物心肌，优选猪心肌，因为其来源广、成本低；其他动 物如牛、羊等的心肌同样可做为原材料。对于本领域的技术人员，可以理解，除心 肌外，其他富含高铁肌红蛋白还原酶的动物肌肉如骨骼肌，同样可参照本专利技术的步 骤，制备高铁肌红蛋白还原酶。本专利技术方法具有产品纯度高，工艺简单、成本低等 优点，既可填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。 图l是DEAE-S邻harose Fast Flow层析图谱图2是CM-Sephadex Fast Flow层析图谱 图3是蓝色琼脂糖Fast Flow亲和层析4是SDS-PAGE和PAGE电泳图其中M.蛋白marker 1.粗提物2.盐析物3.阴离子交换物4.阳离子交换物5. 亲和层析物6.亲和层析物(PAGE电泳) 图5是SDS-PAGE电泳图 其中M.蛋白marker 1.亲和层析物 图6是电泳后凝胶扫描图 其中A是粗提液样品电泳后凝胶扫描图B是经阴离子交换层析样品电泳后凝胶扫描图C是经阳离子交换层析样品电泳后凝胶扫描图D是亲和层析后样品电泳后凝胶扫描图 具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照附图数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这 些实施例及附图只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。 实施例l:高铁肌红蛋白还原酶的制备材料新鲜猪心，阴离子交换层析材料(DEAE-Sepharose Fast Flow, Pharmacia),阳离 子交换层析材料(CM-Sephadex Fast Flow, Pharmacia),蓝色琼脂糖FastFlow亲和 层析凝胶(Affi-Gel Blue Fast Flow, Pharmacia),(猪心肌肌红蛋白(本实验室自制)， EDTA(Amresco公司)，NADH (purity 98%, Amresco公司)，磷酸盐、K4Fe(CN)6等 为国产分析纯，透析袋(1 4000CoMW)，聚乙二醇，考马斯亮蓝试剂盒，其它试剂 均为分析纯。 主要仪器Spectrumlab54紫外可见分光光度计(上海)、722分光光度计(上海)、FJ-200 高速分散匀质机(上海)、PHS-3C型精密pH计(上海)、JB22型恒温磁力搅拌器、超级恒温水浴锅(上海)、生化温冰箱(REVCO，USA)、 LGR10-4.2冷冻高速离心机 (北京)、超低温冰箱(REVCO，USA)、 CXG-1电脑恒温层析系统(上海)、DYY-12 型电泳仪和电泳槽、CS-卯OO Dual-wavelength Flying-spot scanner (SHIMADZU， JAPAN) 方法(1) 粗提取去除脂肪和结缔组织的新鲜猪心，切成小块，用冰冷的生理盐水冲洗，除去残留 的血液。再剁碎，每克肉样加2mL冷水，在冰浴条件下，用FJ-200高速分散均质 机匀浆60 90s，粗匀浆用2NNH40H将pH值调至7.5，静置约30min， 13700g离 心20min，得上清液。(2) 盐析及透析上清液加入固体硫酸铵至40。/。饱和度，pH值调至7.5，搅动30min，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法，包括以下步骤：１）将新鲜动物心肌剁碎，加水匀浆处理，粗匀浆用２ＮＮＨ↓［４］ＯＨ把ｐＨ调至７．５，静置离心、过滤后得粗提液；２）粗提液经４０％－７０％硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液重悬，离心后取上清液对平衡缓冲液透析，透析膜的截留分子量为１４０００，得透析液；所说的平衡缓冲液是０．０２Ｍ磷酸缓冲液，ｐＨ６．０；３）将透析液上样到用缓冲液Ａ平衡的ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阴离子交换层析柱，用缓冲液Ａ冼脱杂蛋白，再用缓冲液Ａ和缓冲液Ｂ进行梯度洗脱，收集合并酶活性部分，浓缩透析；所说的缓冲液Ａ是０．００２Ｍ、ｐＨ７．０、含０．００１ＭＥＤＴＡ的磷酸盐缓冲液；缓冲液ＢＪ是０．２Ｍ、ｐＨ７．０、含０．００１ＭＥＤＴＡ磷酸盐缓冲液；４）将得到的透析液上样到用缓冲液Ｃ平衡过夜的ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＦａｓｔＦｌｏｗ阳离子交换层析柱；用缓冲液Ｃ洗脱杂蛋白，洗脱完后，用缓冲液Ｄ洗脱，收集合并酶活性部分，透析浓缩；所说的缓冲液Ｃ是０．０２Ｍ、ｐＨ６．０磷酸缓冲液，所说的缓冲液Ｄ是０．２Ｍ、ｐＨ６．０磷酸缓冲液；５）将具有酶活组分的洗脱液冷冻干燥后，上样到用缓冲液Ｅ平衡的蓝色琼脂糖凝胶ＦＦ亲和层析，用缓冲液Ｅ洗脱杂蛋白，最后用缓冲液Ｅ和含１．０ＭＮａＣｌ的缓冲液Ｅ组成的线性梯度洗脱，收集具有酶活组分的洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白还原酶；所说的缓冲液Ｅ是０．０３Ｍ、ｐＨ６．０、含０．００１ＭＥＤＴＡ磷酸盐缓冲液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金邦荃，王玮，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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