一种黑骨藤指纹图谱的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种黑骨藤指纹图谱的建立方法，所述方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映黑骨藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，可将黑骨藤质量与其药效真正结合起来，有助于阐明其作用机理为本黑骨藤的技术提升与深度开发提供了依据。且用该方法检测到的黑骨藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，分离度较好。

【技术实现步骤摘要】
一种黑骨藤指纹图谱的建立方法
本专利技术涉及一种黑骨藤指纹图谱的建立方法，属于药品技术的领域；
技术介绍
黑骨藤，系萝藦科科(Asclepiadaceae)植物黑龙骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的干燥根或全株，具有通经、活血、解毒和祛风等功效，用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、月经不调。黑骨藤是常用苗药之一，是黑骨藤追风活络胶囊、黑骨藤伸筋透骨液、黑骨藤伸筋透骨喷雾剂的重要组成药味，是《贵州省中药材、民族药材质量标准》(简称《质量标准》)2003年版收载品种。黑骨藤作为贵州十大苗药之一，由于基础研究比较薄弱，其质量评价体系还不够完善，这严重影响了它的现代化进程。在2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中，黑骨藤项下的质量控制仅有性状、粉末和理化鉴别，质量控制方法较为简单，已无法满足现代基于功效组分进行中药品质评价需求。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，是国际公认的一种控制中药及其制剂质量的有效方法。本文在申请人前期工作基础上，建立黑骨藤的指纹图谱，为黑骨藤基于功效组分的品质评价方法建立提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种黑骨藤指纹图谱的建立方法；该方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；为黑骨藤基于功效组分的品质评价方法建立提供理论依据。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案实现：一种黑骨藤指纹图谱的建立方法，所述指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：称取杠柳毒苷对照品8.00～8.50mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，使其充分溶解，摇匀，用甲醇定容，配制成质量浓度为0.80～0.85mg·mL-1的对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：称取黑骨藤样品1.5～2.5g，按料液比1:20～1:30加入65％～75％乙醇溶液45～55mL，加热回流提取2～4次，每次50～70min；提取液于70℃水浴蒸干，加20～30mL蒸馏水使成混悬液；分别依次用和混悬液等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2～4次，取正丁醇萃取部位，浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移并定容置于10mL容量瓶中，摇匀，0.40～0.50μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)色谱条件：色谱柱：XtimateC18(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长：200～240nm；柱温：20～30℃；进样量：10μL；流动相：乙腈-0.05％～0.15％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速：0.8～1.2mL·min-1；(4)指纹图谱的制作：按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，记录谱图得到黑骨藤指纹图谱；(5)指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次黑骨藤建立了指纹图谱，通过分析比较确定了16个共有峰，这些共有峰构成了黑骨藤的指纹特征，作为黑骨藤的指纹图谱。前述的黑骨藤指纹图谱的建立方法中，所述供试品溶液这样制备：称取黑骨藤样品2.0g，按料液比1:25加入70％乙醇溶液50mL，加热回流提取3次，每次60min；提取液于70℃水浴蒸干，加25mL蒸馏水使成混悬液；分别依次用等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，取正丁醇萃取部位，浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移并定容置于10mL容量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。前述的黑骨藤指纹图谱的建立方法中，所述梯度洗脱是；按下表梯度程序进行梯度洗脱：前述的黑骨藤指纹图谱的建立方法中，所述16个共有峰，以14号峰(杠柳毒苷)为参照峰，其余峰相对保留时间分别为0.0848～0.0849，0.2027～0.2034，0.2811～0.2815，0.3068～0.3080，0.4248～0.4259，0.5747～0.5760，0.7122～0.7148，0.8173～0.8189，0.8362～0.8376，0.8876～0.8881，0.9099～0.9109，0.9366～0.9371，0.9844～0.9846，1.0000～1.0121，1.2837～1.2848。前述的黑骨藤指纹图谱的建立方法中，所述色谱柱：XtimateC18(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长：220nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱。专利技术人进行了大量的实验，以下是本专利技术所述检测方法的研究实验例：苗药黑骨藤指纹图谱研究1仪器与试药1.1仪器赛默飞UltiMate-3000型高效液相色谱仪；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；精密电子天平(JT1003，余姚市金诺天平仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(DRHH-2，上海双捷实验设备有限公司)；高速多功能粉碎机(Q-2508，上海冰都电器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(GZX-GF101-1-S-Ⅱ，上海贺德实验设备有限公司)；定量滤纸(GB/T1914-2007，抚顺市民政滤纸厂)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A、2004B版(国家药典委员会)。1.2试药石油醚(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；三氯甲烷(分析纯，西陇化工股份有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，上海申博化工有限公司)；正丁醇(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；磷酸(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司)；甲醇(色谱纯，美国天地有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；哇哈哈纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司授权贵阳哇哈哈昌盛饮料有限公司制造)。1.3对照品杠柳毒苷(批号：MUST-15072212，成都曼思特生物科技有限公司)。1.4药材来源所有药材均采自贵州省境内，阴干，备用。样品信息详见表1。表1黑骨藤药材采集信息2色谱条件与系统适用性试验色谱柱：XtimateC18(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长：220nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速：1.0mL.min-1；梯度洗脱洗脱程序见表2。表2流动相梯度洗脱程序3对照品溶液的制备精密称取杠柳毒苷对照品8.00mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，使其充分溶解，摇匀，用甲醇定容，配制成质量浓度为0.80mg·mL-1的对照品溶液。4供试品溶液的制备称取黑骨藤样品2.0g，按料液比1:25加入70％乙醇溶液50mL，加热回流提取3次，每次60min；提取液于70℃水浴蒸干，加25mL加蒸馏水使成混悬液；分别依次用等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，取正丁醇萃取部位，浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移并定容置于10mL容量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。5参照物的确定将上述配制好的对照品溶液和供试品溶液按上述色谱条件进行测定，图1中14号峰为杠柳毒苷。6方法学考察6.1精密度试验精密吸取采于惠水县九龙寺(S1)的同一供试品溶液10μL，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录各色谱峰的保留时间和峰面积积分值，将每次进样所得的16个峰的保留时间和峰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑骨藤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：称取杠柳毒苷对照品8.00～8.50mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，使其充分溶解，摇匀，用甲醇定容，配制成质量浓度为0.80～0.85mg·mL

【技术特征摘要】
1.一种黑骨藤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：称取杠柳毒苷对照品8.00～8.50mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，使其充分溶解，摇匀，用甲醇定容，配制成质量浓度为0.80～0.85mg·mL-1的对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：称取黑骨藤样品1.5～2.5g,按料液比1:20～1:30加入65％～75％乙醇溶液45～55mL，加热回流提取2～4次，每次50～70min；提取液于70℃水浴蒸干，加20～30mL蒸馏水使成混悬液；分别依次用和混悬液等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取2～4次，取正丁醇萃取部位，浓缩至干，残渣用适量甲醇溶解，转移并定容置于10mL容量瓶中，摇匀，0.40～0.50μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(3)色谱条件：色谱柱：XtimateC18(250mm×4.6mm,5μm)；检测波长：200～240nm；柱温：20～30℃；进样量：10μL；流动相：乙腈-0.05％～0.15％磷酸水溶液，梯度洗脱，流速：0.8～1.2mL·min-1；(4)指纹图谱的制作：按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，记录谱图得到黑骨藤指纹图谱；(5)指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次黑骨藤建立了指纹图谱，通过分析比较确定了16个共有峰，这些共有峰构成了黑骨藤的指纹特征，作为黑骨藤的指纹图谱。2.如权利要求1所述的黑骨藤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述供...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，刘育辰，李悦，张葭，金文渊，颜智，袁思文，刘丽苹，陈冰，
申请(专利权)人：贵阳中医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52