一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法技术

一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题。构建方法：先克隆ＫａｎＲ基因、ＸＫＳ１基因、ＡＤＨ１终止子片段、酿酒酵母中２．２ｋｂ　ｒＤＮＡ片段；然后回收、纯化基因片段与ｐＧＥＭＴ　Ｅａｓｙ载体连接；再依次构建质粒ｐＲ、质粒ｐＲＫ和质粒ｐＲＫＴ；最后将２．２ｋｂ　ｒＤＮＡ片段加入质粒ｐＲＫＴ。本发明专利技术方法所构建的载体可以将ＸＫＳ１基因高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，实现ＸＫＳ１的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆质粒ｐＫＴ０１５０中ＫａｎＲ基因；二、克隆酿酒酵母ＸＫＳ１基因；三、克隆质粒ｐＫＴ０１５０中ＡＤＨ１终止子片段；四、克隆酿酒酵母中２．２ｋｂｒＤＮＡ片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体在１６℃的条件下连接１０～１２ｈ，得到ｐＧＭＴ－ＫａｎＲ、ｐＧＭＴ－ＸＫＳ１、ｐＧＭＴ－ＡＤＨ１Ｔ和ｐＧＭＴ－ｒＤＮＡ；六、构建质粒ｐＲ，以酿酒酵母整合载体ｐ４０６ＡＤＨ１为骨架引入有抗性标记的基因ＫａｎＲ；七、构建质粒ｐＲＫ，将ＸＫＳ１基因加入质粒ｐＲ；八、构建质粒ｐＲＫＴ，将ＡＤＨ１终止子片段加入质粒ｐＲＫ；九、将２．２ｋｂｒＤＮＡ片段加入质粒ｐＲＫＴ，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为５’－ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣ－３’，下游引物序列为５’－ＣＴＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡ－３’；步骤二中扩增上游引物序列为５’－ＣＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＣ－３’，下游引物序列为５’－ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧ－３’；步骤三中扩增上游引物序列为５’－ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴ－３’，下游引物序列为５’－ＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧＣＧＧ－３’；步骤四中扩增上游引物序列为５’－ＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＣＣＴＣＴＡＡＴＣＡＴＴＣＧＣＴ－３’，下游引物序列为５’－ＴＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＧＡＧＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：平文祥，葛菁萍，凌宏志，宋刚，杜春梅，赵丹，高冬妮，曹喜生，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]