鱼类家系建立和抗病高产良种选育方法技术

一种鱼类家系建立和抗病高产良种选育方法，采用群体选育、家系选育、杂交以及人工感染、快速生长家系和抗病家系的筛选等技术，选育出了牙鲆抗病方强、生长快的家系，建立了鱼类抗病高产良种的选育方法。该技术具有针对性强、选育效率高、效果明显等特点，抗病牙鲆鱼苗的成活率为８０％以上，成活率比普通牙鲆鱼苗提高了３０％以上；抗病牙鲆的生长速度也提高了１０％以上。为鱼类抗病品种培育开辟了新的技术途径，是一种能在鱼类良种选育中应用的抗病高产品种选育方法，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类抗病高产良种培育具有重要意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产养殖领域中的鱼类抗病高产品种的选育方法，是一种 能在鱼类良种选育中应用的抗病高产良种选育方法。 背景4支术鱼类是重要的水产养殖种类，也是人类重要的食品来源。我国是世界 上水产养殖产量最高的国家。目前我国养殖鱼类的年产量达到2000多万 吨，除满足我国国内市场外，每年约有30万吨鱼产品出口国外，为我国 出口创汇的主要农产品之一。不过，近年来，随着鱼类养殖业的快速发 展，病害频发、种质退化、苗种成活率低，给鱼类养殖业造成的经济损失 每年高达150多亿元人民币，从而极大地限制了我国鱼类养殖业的发展。目前危害鱼类的主要病害是细菌性和病毒性疾病，前者造成的危害更 大，其中危害最大的一种细菌性疾病，是由鳗弧菌引起的弧菌病(周丽 等，1997 )。尽管采取抗菌素类药物等传统的防病措施，但仍无法从根本 上解决牙鲆等鱼类养殖的病害问题；并且抗菌素类药物具有容易在鱼体内 积累、对消费者的健康具有潜在危害、容易使病原菌产生抗药性以及严重 污染养殖环境等问题，因而在鱼类养殖业中的应用越来越受到限制；同时 抗菌素的使用也不能满足人们日益增长对无药物残留绿色水产品的需求。因此，采用现代生物技术培育抗病力强、生长速度快的养殖鱼类新品 种，已成为我国水产科技必须解决的重大i果题，也是解决鱼类病害问题的 根本途径。在鱼类遗传育种方面，国内自二十世纪80年代开始，在淡水 鲤科鱼类上开展了 一些杂交育种的研究工作，通过不同鲤鱼之间的杂交相 继培育出快速生长的颖鲤(潘光碧等，1989 )、建鲤(张建森等，1994 ) 等新品种。在海水鱼类遗传育种研究方面，主要在牙鲆、大黄鱼和大菱鲆 上开展了人工雌核发育培育单性苗种的研究工作(王新成等，1997;王晓 清等，2006;苏鹏志等，2008 )，同时，还开展了一些分子标记筛选和遗 传多样性评价、种质鉴定以及抗病相关分子标记筛选等方面的研究工作，如邹曙明等(2000 )采用RAPD技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进 行的检测分析；尤峰等(2001 )采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙 鲆的遗传多样性进行的分析；Liuetal. (200 5a， b)利用孩￡卫星标记和 AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明养殖群体的遗 传多样性具有一定程度的下降；陈微等(2005 )开展了牙鲆微卫星标记筛 选和遗传多样性的分子研究；张玉喜等(2006 )分析了牙鲆抗病鱼和不抗 病鱼的MHC基因多态性，初步筛选到抗病相关的MHC基因型；但有关鱼类 抗病家系建立以及抗病高产良种的选育，目前尚未见才艮道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供鱼类家系建立和抗病高产良种选育的技术方 法，为鱼类抗病高产品种培育提供技术手4殳。本专利技术其
技术实现思路
如下包括鱼类家系建立和抗病高产良种选育的技 术方法；一、鱼类家系建立方法；包括(一)、抗病群体的制备；(二)、 夷类家系的建立；(三)、不同家系的标记方法。(一)、抗病群体的制备采用自然选择和人工感染途径获得抗病群 体(RS)。自然选择在发病旺季，收集弧菌病发病后存活的鱼苗和鱼种个体， 进行培养；人工感染途径用病原菌鳗弧菌感染普通鱼苗 鱼苗为牙鲆黄海群体普通鱼苗，体重为15-20克/尾； 鳗弧菌为本实验室保存的鳗弧菌菌抹，鳗弧菌的培养基为2216E,将 鳗弧菌接种在灭菌的2216E培养基(蛋白胨5g,酵母提取物lg， FeP04 . 4H20 0. lg,陈海水lOOOmL)中，置于震动速度为200r/m的摇床 上，于28。C下进行培养，20小时后测定OD600值，离心收集菌体，将原 菌液用灭菌的0. 9% NaCl生理盐水稀释成浓度为10 OD的菌液。用上述菌液进行预感染实验先用生理盐水将IO OD浓度的菌液分别 稀释成不同的浓度(稀释50、 100、 120、 150、 240和300倍)进行预备 实验，每个浓度注射10尾15-20克重的鱼苗，注射量为0. 3-0. 5mL。将引起注射的鱼苗中50-60°/ 的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度。上述规 格的鱼苗的半致死浓度为0. 3-0. 5mL的稀释240倍的细菌溶液。感染实验正式感染试验用牙鲆共800多尾，体重约15-20 g,牙鲆 个体腹腔注射鳗弧菌，注射剂量控制在半致死浓度，鳗弧菌溶液的注射量 为0. 02 ml菌液/克鱼。感染时水温控制在21-23°C。抗病群体(RS)为自然选择或人工感染鳗弧菌后长期健康成活的个体。 (二)、鱼类家系的建立；鱼类为牙鲆日本群体(JS)和牙鲆黄海群体亲 鱼(YS):1、牙鲆日本群体(JS)和黄海群体亲鱼(YS)的培育从曰本引进牙鲆鱼苗50尾，体长5厘米左右，经过3-4年的培育， 鱼苗达到性成熟，用于建立牙鲆家系；黄海野生群体亲鱼为捕捞的野生个 体，采用常规方法进行驯养和繁殖。采用电子标记法对抗病群体(RS)、日本群体(JS)以及黄海野生群体 (YS) 3个群体亲鱼进行个体标记，每尾亲鱼给一个标记号，以便配对繁殖 时识别亲鱼来源。2 、精、卵的采集与人工授精利用人工挤压腹部法分别采集成熟卯，挤压并用吸管吸取成熟精子于 干燥的玻璃瓶中。采用干法受精，即将挤出的精液加到盛卵的容器中，摇 动混合，然后加入15-16。C海水激活，完成授精过程，再加10倍于卵量 的海水，静置5-10分钟，好卵漂浮在上面，而未受精的死卵则沉于水 底，将上浮卵移入孵化缸中孵化，胚胎发育至原肠早期统计受精率，发育 至出膜前期统计孵化率。3 、家系的建立在牙鲆繁殖季节，采用抗病群体(RS)、日本群体(JS)和黄海野生群体 (YS) 3个繁殖群体作为亲本进行配对繁殖。采用抗病牙鲆$ x抗病牙鲆？ 、抗病牙鲆$ x日本牙鲆？；日本牙鲆Sx抗病牙鲆？、日本牙鲆Jx日 本牙鲆？；黄海野生牙鲆$ x抗病牙鲆？、黄海野生牙鲆$ x日本牙鲆 ,分别以1尾雄鱼对1尾雌鱼的交配方式构建家系，有时是1尾雄鱼分别对2-4尾雌鱼，或1尾雌鱼分别对2-5尾雄鱼的交配方式构建半同胞家 系。精、卵采集及孵化按上述方法进行。将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配 产生的受精卵，即一个家系，放在一个3立方米体积的水槽中进行孵化， 放养密度为20-30毫升受精卵，水槽实行24小时微流水、充气。家系的 建立工作应在10-20天内完成。(三)、不同家系的标记方法采用不同颜色的焚光染料注射鱼苗的不同部位，将配制好的不同颜色 的荧光染料注入鱼体表皮下，每针注射剂量为3-5 yl。选取黄、红、橙3 种荧光颜料，在鱼体腹部上选取了背前、背后、腹后3个位置，利用排列 组合法设计了标记组合，按1个部位1种颜色，1个部位2种颜色和1个 部位3种颜色进行排列组合，共计有3375个排列组合，即利用3种颜色 在3个不同部位注射，可以标记3375个家系。二、抗病高产良种选育方法；包括(一)、快速生长家系的筛选； (二)、抗病家系的筛选。(一)、快速生长家系的筛选在家系建立后至荧光标记前，不同家系祠养在不同的养殖水槽内，不 同家系的饲养密度应保持相同，3立方米的7jc槽中养殖5000-10000尾初 孵仔鱼。当鱼苗生长20天后，水槽中鱼苗的密度调整为3000-5000尾； 当鱼苗生长至45天后，其密度调整为1000-1500尾；当鱼苗生长至8-10 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类家系建立方法，其特征在于它的技术内容包括：（１）、抗病群体的制备；（２）、鱼类家系的建立；（３）、不同家系的标记方法；（１）、抗病群体的制备：采用自然选择和人工感染途径获得抗病群体（ＲＳ）；自然选择：在发病旺季，收集弧菌病发病后存活的鱼苗和鱼种个体，进行培养；人工感染途径：用病原菌鳗弧菌感染牙鲆普通鱼苗：鱼苗体重为１５－２０克／尾；鳗弧菌为本实验室保存的鳗弧菌菌株，鳗弧菌的培养基为２２１６Ｅ，将鳗弧菌接种在灭菌的２２１６Ｅ培养基中，置于震动速度为２００ｒ／ｍ的摇床上，于２８℃下进行培养，２０小时后测定ＯＤ６００值，离心收集菌体，将原菌液用灭菌的０．９％ＮａＣｌ生理盐水稀释成浓度为１０ＯＤ的菌液；２２１６Ｅ培养基的配方是：蛋白胨５ｇ，酵母提取物１ｇ，ＦｅＰＯ↓［４］.４Ｈ↓［２］Ｏ０．１ｇ，陈海水１０００ｍＬ；用上述菌液进行预感染实验：先用生理盐水将１０　ＯＤ浓度的菌液分别按５０、１００、１２０、１５０、２４０和３００倍，稀释成不同的浓度进行预备实验，每个浓度注射１０尾１５－２０克重的鱼苗，注射量为０．３－０．５ｍＬ；将引起注射的鱼苗中５０－６０％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度；上述规格的鱼苗的半致死浓度为０．３－０．５ｍＬ的稀释２４０倍的细菌溶液；感染实验：正式感染试验用鱼苗共８００多尾，体重约１５－２０ｇ，鱼苗实行腹腔注射鳗弧菌，注射剂量控制在半致死浓度，鳗弧菌溶液的注射量为０．０２ｍｌ菌液／克鱼；感染时水温控制在２１－２３℃；抗病群体为自然选择或人工感染鳗弧菌后长期健康成活的牙鲆个体；（２）、鱼类家系的建立；鱼类为牙鲆日本群体和牙鲆黄海群体：ａ、牙鲆日本群体和黄海群体亲鱼的培育：从日本引进牙鲆鱼苗，体长５厘米左右，经过３－４年的培育，鱼苗达到性成熟，用于建立牙鲆家系；黄海野生群体亲鱼为捕捞的野生个体，采用常规方法进行驯养和繁殖；采用电子标记法对抗病群体、日本群体以及黄海野生群体３个群体亲鱼进行个体标记，每尾亲鱼给一个标记号，以便配对繁殖时识别亲鱼来源；ｂ、精、卵的采集与人工授精：利用人工挤压腹部法分别采集成熟卵，挤压并用吸管吸取成熟精子于干燥的玻璃瓶中；采用干法受精，即将挤出的精液加到盛卵的容器中，摇动混合，然后加入海水激活，完成授精过程，再加１０倍于卵量的海水，静置５－１０分钟，好卵漂浮在上面，而未受精的死卵则沉于水底，将上浮卵移入孵化缸中孵化，胚胎发育至原肠早期统计受精率，发育至出膜前期统计孵化...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，田永胜，徐田军，邓寒，沙珍霞，刘本伟，季相山，于过才，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]