板栗的组织培养方法及其专用培养基技术

本发明专利技术公开了一种繁殖板栗的方法及其专用培养基。本发明专利技术培养基，是在ＷＰＭ培养基中添加包括ＩＢＡ和下述两种激素中的至少一种得到的培养基：ＫＴ和ＴＤＺ；所述ＩＢＡ的终浓度为０．１－１．０ｍｇ／Ｌ，所述ＫＴ或ＴＤＺ的终浓度为０．５－１．０ｍｇ／Ｌ。本发明专利技术培养基筛选出了适合中国板栗生长的激素种类、抗生素种类、防褐化物质等，解决了目前中国板栗培养中存在的污染和褐化问题，成功建立了中国板栗成年树的无菌培养体系。用本发明专利技术培养基培养板栗的方法操作简单、成本低廉，适合于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种板栗的组织培养方法及其专用培养基。技术背景板栗是一种重要的经济作物，全身是宝，例如，板栗果实具有重要的营养价值， 可加工成多种食品；板栗树材质坚硬，纹理通直，防腐耐湿，是制造军工、车船、 家具等良好材料；其枝叶、树皮、刺苞富含单宁，可提取烤胶；花可作为是很好的蜜源等等。正是由于板栗具有诸多重要的应用价值，市场需求大，所以人们越来越注重其优良品种的培育。尤其是在20世纪初，美国发生的栗疫病(Cryphonectria parasitica(Murr.)Barr)，引起了前所未有的大面积生态环境灾害，几乎毁灭了美国 东部所有天然的栗树林，此后，育种学家们更加注重培育抗疫病性的板栗新品种。离体培养技术作为现代育种技术的基础和良种繁育的重要手段，受到了极大地 青睐。栗属树种离体培养最早是Jacquiot开始尝试的，1971年，Borrot完成了对 茎形成层的研究，以成熟板栗树(IOO年以上)的形成层做外植体，经过离体培养 形成愈伤组织，随后在Trippi等人的研究中，也只获得了愈伤组织(callus tissue)， 而未见器官分化或只分化到"类芽组织"或芽原基。中国板栗(CastaneamollissimaBL.)具有抗疫病性(blight-resistance)和抗黑 水病(inkdisease)的优良特性，是一种良好的种质资源。但是中国板栗极难生根， 扦插繁殖生根率很低，而在生物技术方面的研究很少，还未见中国板栗成年树无菌 培养体系的成功报道。其有关组培技术的欠缺极大地束缚了现代生物技术在板栗的 科研、生产中的应用与发展。 专利技术内容本专利技术的一个目的是提供一种用于培养板栗的培养基。本专利技术所提供的板栗培养基，是在WPM培养基中添加包括IBA和下述两种激素 中的至少一种得到的培养基KT和TDZ;所述IBA的终浓度为0. 1-1. Omg/L，所述 KT或TDZ的终浓度为0. 5-1. Omg/L。为了防止内生菌的产生，所述培养基还可以包括终浓度为250-500 rag/L的头 孢霉素。为了防止褐化，所述培养基还可包括终浓度为3-5g/L的活性炭。 其中，所述IBA的终浓度优选为0. 1 irig/L，所述KT或TDZ的终浓度优选为 1. Omg/L，所述头孢霉素的终浓度优选为250mg/L，所述活性炭的终浓度优选为4g/L。 本专利技术的另一个目的是提供一种组织培养板栗的方法。本专利技术所提供的组织培养板栗的方法，包括如下步骤以板栗带腋芽的茎段为 外植体，利用上述任一所述培养基进行组织培养，得到板栗组培苗。所述培养的条件可以为温度为23土2。C、相对湿度为50-60%、光强为 2000-2500Lx、光照明暗周期为14小时光照/10小时黑暗。所述茎段取自板栗成年树的春季新生枝条。为了改变外植体材料表面所携带真菌及细菌的正常生活温度，在杀菌前使其生 理代谢产生紊乱，从而增加外植体的成活率，而又能保证新生枝条维持正常的生命 代谢，所述新生枝条在所述初代培养前最好先在4'C条件下保存24h。上述培养基及培养方法适合于一般板栗的培养，如中国板栗，具体可以为中国 板栗燕红。本专利技术培养基筛选出了适合中国板栗生长的激素种类、抗生素种类、防褐化物 质等，解决了目前中国板栗培养中存在的污染和褐化问题，成功建立了中国板栗成 年树的无菌培养体系。用本专利技术培养基培养板栗的方法，成功筛选出了建立中国板 栗成年树无菌培养体系的外植体材料——板栗成年树春季枝条，保证了优良性状的 遗传稳定性，完善了杀菌处理方法，还具有操作简单、成本低廉。因此，本专利技术培 养基及板栗培养方法适合于推广应用。附图说明图1为中国板栗燕红初代培养的生长情况。 图2为中国板栗燕红的继代培养的生长状况。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例中用到的试剂及基本培养基如下琼脂、蔗糖、活性炭、滤纸、封口膜、75%乙醇、95%乙醇、硝酸铵、硝酸钙、 硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、钼酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硼酸、 乙二胺四乙酸钠铁、甘氨酸、肌醇、Ph试纸、盐酸硫胺素、盐酸吡卩多醇、核黄素均购自北京广达恒益科技有限公司。3-吲哚丁酸(IBA) 、 6-糠氨基嘌呤(KT)、噻苯隆(TDZ)、头孢霉素均购自 北京华夏康源科技有限公司。升汞购自上海开通化工有限公司。草酸铵结晶紫、碘液、蕃红(或沙黄)购自上海生工生物工程有限公司。 本专利技术利用WPM培养基为基本培养基，具体的营养成分如下表l、 WPM基本培养基组成 (mg/L)<table>table see original document page 5</column></row><table>实施例1、板栗离体培养各实验条件的探索 一、激素种类及浓度的选择设3个实验组，筛选方法如下实验1:将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1. 0mg/L的细胞分裂素KT 和O. 1 mg/L的生长素IBA的培养基中，在23士2。C、相对湿度50-60%、光强 2000-2500Lx、每天光照10小时的条件下进行培养30天，观察茎段生长状况，结 果100%的茎段开始有腋芽萌发。实验2:将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1. 0mg/L的KT和0. 1 mg/L 的BA的培养基中，进行培养，培养条件等均与实验l所述相同。结果都没有腋芽 萌发，最后茎尖干枯死亡。实验3:将中国板栗燕红的带腋芽的茎段接种于含有1. Omg/L的TDZ和0. 1 mg/L 的IBA的培养基中，进行培养，培养条件等均与实验l所述相同。结果100%的茎段 开始有腋芽萌发。因此，以上实验表明，在培养基中添加终浓度为1.0mg/L的KT (或TDZ)和终 浓度为O. 1 mg/L的IBA，可有效促进中国板栗茎段腋芽萌发，而相同质量浓度的 BA效果较差，腋芽不萌动。二、抗生素的筛选方法本专利技术分别在WPM培养基中添加250 mg/L头孢霉素和25mg/L利福平， 其抑菌效果如表2所示。表2、抗生素的抑,对效果比对<table>table see original document page 6</column></row><table>结果表明，在WPM培养基中添加250 mg/L头孢霉素可有效抑制外植体材料的 污染率，比25mg/L利福平的效果要好。 三、防褐化物质的筛选方法本专利技术以常用的防褐化物质Vc、 PVP、颗粒状活性炭、粉末状活性炭等 为实验原料，将其分别以常用的浓度，分别添加到WPM培养基中。结果表明，添加100mg/L的Vc和lg/L的PVP均褐化严重；颗粒状活性炭聚集 于培养基底部，防止褐化效果较差；粉末状活性炭可溶解于培养基中，防止褐化效 果较好。实施例2、中国板栗燕红的离体培养 一、外植体材料的获得及消毒处理取材于北京4月底至5月初晴天上午，取中国板栗燕红成年树春季新生枝条，用湿报纸包裹材料放入4'C冰箱24h (注意此时不要用流水冲洗外植体材料)，然 后将材料剪成lcm左右带腋芽的茎段，去除大叶片，流水冲洗。取材时间很重要，是关系到无菌体系能否成功建立的决定因素。本专利技术通过实验表明，冬季休眠芽、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种板栗培养基，是在ＷＰＭ培养基中添加包括ＩＢＡ和下述两种激素中的至少一种得到的培养基：ＫＴ和ＴＤＺ；所述ＩＢＡ的终浓度为０．１－１．０ｍｇ／Ｌ，所述ＫＴ或ＴＤＺ的终浓度为０．５－１．０ｍｇ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩振海，孙宁，王忆，许雪峰，李天忠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]