蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法技术

本发明专利技术公开了一种包括以下步骤：选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生２０天以内的新枝为外植体；对外植体清洗消毒；外植体接种培养。腋芽启动培养基：ＭＳ或改良ＭＳ＋６－ＢＡ０．１～０．６ｍｇ／ｌ＋Ｋｔ０．１～０．６ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．０１～０．１ｍｇ／ｌ。改良ＭＳ＋６－ＢＡ０．２～０．５ｍｇ／ｌ＋Ｋｔ０．０４～０．４ｍｇ／ｌ＋Ｚｔ０．２～０．５ｍｇ／ｌ＋ＮＡＡ０．０１～０．０５ｍｇ／ｌ。本发明专利技术的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需的环境条件。用本发明专利技术的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存，又可进行试管嫁接培育大批量优质种苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物生物技术，尤其涉及一种蜜橘成年树营养器官离体丛 生芽培养方法。
技术介绍
柑橘居世界百果生产之首，其果实营养丰富，色香味兼优，既可鲜食，又 可加工果汁制品。南丰蜜橘是柑橘类宽皮橘中著名的优良品种。南丰蜜橘源出 乳桔,又是乳桔中的精品，最突出特点在于皮薄金黄、酸甜适口、香气浓郁、汁 多核少，誉为"橘中之王"驰名中外，它是我国特有的优良柑橘栽培品种。蜜橘成年树茎器官离体腋芽丛生培养对快速繁殖优质种苗和种质离体保 存具有重要作用，它能较好地保持品种的遗传稳定性。我国利用组织培养进行 柑橘快速繁殖的研究工作较广泛，上世纪七十年代王大元报道后至今，有不少 文献报告了柑橘科属的多种植物离体不定芽或丛芽的产生，但选用的外植体几 乎大都是未渡越童期的组织，很少见成年态营养体组织培养再生芽的报道。原 因有两点 一是成年结果柑橘树的枝茎外植体表面灭菌困难；二是成年态柑橘营养器官组织离体再分化难。而柑橘成年态茎段离体培养是柑橘优良品系工厂 化育苗及其种质离体保存等的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养再 生体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种， 同时提供相应的培养基质。本专利技术方法包括以下步骤(1.1) 选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生20天以内的 新枝为外植体；(1.2) 对外植体清洗消毒；(1.3) 外植体接种在培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四 周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长12 15天，此时主腋芽伸 长迅速；(1.4) 培养30 40天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，接种 到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30 40天，平均每个培养物分化出丛生 芽4 6个，芽长2 3cm;(1.5)分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到增殖 培养基上继代培养，以后每30 40天转代一次，繁殖系数4 6;建成丛芽无性 繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩本专利技术方法所用的培养基如下(1) 改良MS培养基，改良MS含以下改良的有机成分甘氨酸2.0mg/L， VBi 1. 0 2.0mg/L， VB6 1.0 2. Omg/L，烟酸O. 5 1. Omg/L，肌醇100mg/L，叶酸O. l 1.0mg/L，蔗糖40 55g/L，其它成分不变。(2) 腋芽启动培养基MS +6-BAO. 1 0. 6 mg/L+Kt0. 1 0. 6 mg/L +NAAO. 01 0. 1 mg/L。(3) 芽增殖培养基改良MS +6-BA0. 2 0. 5 mg/L +KtO. 04 0. 4 mg/L +ZtO. 2 0, 5 mg/L +NAAO. 01 0. 05 mg/L。本专利技术的培养条件如下(1) 培养参数恒温24 ±2°C，相对湿度60% 70%，光照强度为1000 16000让， 日照时长11 14小时/天。(2) 技术参数外植体污染率低于5% 10%;腋芽萌动诱导率75% 87%;芽丛 生增殖系数4 6;继代周期30 40天。本专利技术方法中对外植体清洗消毒过程中对外植体清洗消毒过程中先用偏 酸性牙膏溶液浸洗杀菌，再用碱性洗衣粉液浸洗杀菌；最后用75%的乙醇溶液 和0.1% 0.5Q/。HgCl2溶液消毒。本专利技术的培养方法及基质配方为蜜橘成年态茎节腋芽离体再生提供必需 的环境条件。用本专利技术的方法进行南丰蜜橘的离体培养，可获得大量的再生芽。 利用这样的柑橘离体再生芽既可作种质保存材料，又可切取lcm的茎端进行试 管嫁接培育大批量优质种苗。这对南丰蜜橘以及柑橘类优良种质的离体繁殖或 种质离体保存均具有广泛的实用价值。 附图说明图1为本专利技术南丰蜜橘成年态茎节腋芽萌动诱导图2为本专利技术芽丛生增殖培养图。 具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术进行详细说明。 实施例h(一)、选择健壮无病虫害南丰蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d (天) 以内的成年态茎抽生新枝，(二)、用自来水洗去灰尘，再用偏酸性商品牙膏适量溶于水，浸泡嫩枝条6 10 min，再用软毛笔刷洗枝叶后，自来水漂洗干净；再用碱性洗衣粉液浸 洗6 10min，自来水细流水中漂洗干净，修整老叶枝后用蒸馏水冲洗1 3次，滤纸吸干水滴后装入无菌容器中进行表面灭菌处理；转至超净工作台上，先以 75%的乙醇溶液浸泡20 305，无菌水冲洗2 4次，再O. 1% 0. 59fflgCl2浸泡柑 橘新枝6 10 min，倾去药液后，用无菌水冲洗5 6次。然后在无菌条件下， 将柑橘新枝切成长度为0.5 lcm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的培养 基上培养。(三)、培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点， 继续在腋芽启动培养基上生长12 15天，此时主腋芽伸长迅速，接种后培养30 40天时，将长出的腋芽从外植体(母枝)上分割下来，又 接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养30 40天，平均每个培养物分化出 丛生芽4 6个，芽长2 3cm;(四)、分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到 增殖培养基上继代培养，以后每30 40天转代一次，繁殖系数4 6;建成丛芽 无性繁殖体系，繁殖的2cm以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继 代扩繁。(五)培养条件1. 培养基配方对培养基中的大量元素、微量元素、有机成分、植物激素、糖类等各个组 成成分进行多次正交设计及梯度试验基础上得到。本专利技术基本培养基为改良 MS:大量元素、铁盐、微量元素三者与MS培养基中相同；有机成分(改良) 用量为甘氨酸2.0/L， VBi 1.0 2.0mg/L， VB6 1.0 2.0mg/L，烟酸0.5 1.0mg/L，肌醇100mg/L，叶酸0.1 1.0mg/L;蔗糖改为40 55g/L。 (1)腋芽启 动培养基MS (或改良MS) +6-BA0.1 0.6 mg/L (单位下同)+Kt0.1 0.6+NAA0.01 0.1; (2)芽增殖培养基改良MS +6-BA0.2 0.5+Kt0.04 0.4+Zt0.2 0.5+NAA0.01 0.1;以上培养基的pH值5.8 6.0、琼脂粉0.6% 0.62。/。，并在118 120。C高温高压下灭菌25min。2. 培养环境提供培养环境恒温(24 ±2)°。，相对湿度60% 70%，光照强度为1000 翻lx ，日照时长11 14 h (小时)/d (天) 实施例2:选择健壮无病虫害蜜橘成年优株果树，取当年抽生20d (天)以内的成年 态茎抽生新枝，对外植体清洗消毒时先以75%的乙醇溶液浸泡20 303，无菌水 冲洗2 4次，再O. 1%浸泡柑橘新枝10 min，在无菌条件下，将柑橘新枝切成长 度为0.5 lcm左右的小段(带茎节)，接种到准备好的培养基上培养。(1)腋芽 启动培养基MS+6-BA0.1 mg/L(单位下同)+Kt0.1+NAA0.01; (2)芽增殖培养 基改良MS十6-BA0.2+Kt0.04+Zt0.2+NAA0.01，其它与实施例l相同。 实施例3:(1)腋芽启动培养基改良MS+6-BA0.2mg/L(单位下同)+Kt0.6+NAA0.1; (2)芽增殖培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜜橘成年树营养器官离体丛生芽培养方法，其特征在于：包括以下步骤：　（１．１）选择健壮无病虫害蜜橘结过果实的成年优株，取当年抽生２０天以内的新枝为外植体；　（１．２）对外植体清洗消毒；　（１．３）外植体接种在培养基上培养至腋芽生长点开始萌动，并在芽的基部四周出现黄绿色小凸点，继续在腋芽启动培养基上生长１２～１５天，此时主腋芽伸长迅速；　（１．４）培养３０～４０天时，将长出的腋芽从外植体（母枝）上分割下来，接种到芽增殖培养基上诱导丛芽分化，培养３０～４０天，平均每个培养物分化出丛生芽４～６个，芽长２～３ｃｍ；　（５）分割继代，小芽成块继代培养，大芽切割成顶芽和茎节，接种到增殖培养基上继代培养，以后每３０～４０天转代一次，繁殖系数４～６；建成丛芽无性繁殖体系，繁殖的２ｃｍ以上芽可进行嫁接育苗，小苗作离体种质保存或继代扩繁。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：涂艺声，徐志祥，蔡险峰，张杨军，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]