一种表达人CDC25 B3质粒及其构建方法技术

一种表达人ＣＤＣ２５　Ｂ３的质粒，该质粒是含有ＣＤＣ２５Ｂ３的载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），其中ＣＤＣ２５Ｂ３具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核苷酸序列，可由ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中的ＰＣＭＶ启动子表达。一种构建表达人ＣＤＣ２５　Ｂ３的质粒的方法。本发明专利技术提供一种表达人ＣＤＣ２５　Ｂ３质粒及其构建方法，该质粒转染低表达ＣＤＣ２５Ｂ蛋白的肿瘤细胞可以使ＣＤＣ２５Ｂ蛋白高表达，可以用于探讨ＣＤＣ２５Ｂ３基因的潜在致癌机制，在医学上具有重要的应用价值；同时本发明专利技术也提供了该质粒的构建方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学中基因工程
，特别涉及一种表达人CDC25 B3 质粒及其构建方法。二
技术介绍
现有技术CDC25家族是一组在细胞周期调控中发挥巨大作用的苏/酪氨酸 双功能酶，CDC25B(cdl division cycle 25 homolog B)是CDC25双功能磷酸酶家族 重要成员之一。CDC25B基因位于人类染色体20p13,由M期诱导结构域和疏氰 酸生成酶结构域构成。不同的剪切方式可产生不同的剪切体，迄今为止一共发现 5种CDC25B的mRNA，但只发现3种CDC25B蛋白(CDC25B1、 CDC25B2、 CDC25B3)，三种剪切体有约95.5%的序列是一致的。CDC25B对细胞周期的正 常运行起着重要的生物学作用，整个细胞周期都能监测到CDC25B的mRNA的 转录。它不仅对细胞周期的S期起推进作用，还对G2/M期过渡起"4M几，，作用， 对G2/M期起检验点作用。胎鼠肝脏中过量表达CDC25B，敲除CDC25B的雌性 小鼠丧失了生育能力，提示CDC25B可能与胚胎发育和卵细胞的发育相关。目前已有相当的研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如前列腺癌、食管磷状 细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、胃癌、肺非小细 胞癌、结肠癌、非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、曱状腺癌等都均存在不同比例 CDC25B的过度表达。其中在乳腺癌、卵巢癌(30% )及结直肠癌(43% )的研 究中发现过量表达的CDC25B与肿瘤的恶性度，转移及患者的预后相关。在非 霍奇金瘤的研究中，CDC25B2的报道在56y。的样本中过度表达，虽然未发现与肿 瘤的侵袭性及患者预后相关，但与患者死亡率相关。在曱状腺恶性淋巴瘤的研究 中发现CDC25B过量表达率为63.80/。，远远高于慢性甲状腺炎，提示在CDC25B甲 状腺恶性淋巴瘤转化中发挥着重大作用。食道磷状细胞癌的研究中，研究者发现 高CDC25B的患者对放疗高度敏感，高表达CDC25B是否与不良预后相关目前还 没有定论。在食道癌细胞林的研究中发现过量表达CDC25B可以增强射线所诱导 刁亡的效应。文献报道在胃癌中高达49%的标本中有CDC25B过度表达且与肿瘤分期、浸润的深度、淋巴结转移呈正相关。在早期子宫内膜癌中过量的CDC25B (90% )与ER-a (65% )是相关的，而在晚期子宫内膜癌中CDC25B表达仅为42 %，而ER-a则降为17。/。。可见在子宫内膜癌发生的早期CDC25B与ER-a可能有协 同刺激转化的作用。在前列腺癌中CDC25B过度表达率高达97。/。，过度表达的 CDC25B可增强雄激素的转录激活作用，有助于前列腺癌向非雄激素依赖性生长 转化。在肺非小细胞癌、头颈部肿瘤、神经母细胞瘤的CDC25B的表达率为40 %、 50%、 85%。这些都表明CDC25B过度表达对于肿瘤的发生、发展有关键性 作用，可能是潜在的诊断标记和治疗靶点，CDC25B与胰腺癌的关系目前研究还比较少，Guo J等研究发现CDC25B在胰 腺癌原发灶和转移灶及正常胰腺的表达分别为48.6±16.3% 、 71.7±3.1% 、 8.3±1.8%,显然CDC25B在胰腺癌组织中是过度表达的，而且转移灶的表达明显 高于原发灶。CDC25B特异性抑制剂作用于高表达CDC25B的人胰腺癌细胞林发 现，抑制剂可以明显抑制该细胞眛的生长并发生G2/M期阻滞。我们的研究中，通过寡核苷酸基因芯片技术发现，CDC25B基因在24例胰腺 癌组织中，有20例(83.3% )表达上调，与正常组织相比，其在胰腺癌中表达明 显增高；通过Westem blot发现，所有正常胰腺组织只有很弱、甚至没有CDC25B 的蛋白表达，而胰腺癌组织中则有较强的CDC25B蛋白表达。经过计算机扫描后 定量分析，正常胰腺组织。00258蛋白表达为1.22±0.33,胰腺癌组织为5.56士1.57， 上调4.56倍。细胞实验中，我们通过对四种胰腺癌细胞抹中CDC25B的三种剪切 异构体的研究发现，在转录水平，Panc-1中CDC25B1与CDC25B2的表达强度无明 显差异；CFPAC-1和SW-1990的CDC25B2的表达高于CDC25B1;而Bxpc-3的 CDC25B1的表达强度高于CDC25B2， CDC25B3在四种胰腺癌细胞林中表达均不显 著。Western blot结果提示CDC25B蛋白在Panc-l和CFPAC-l过度表达，SW-1990 的表达强度中等，Bxpc-3弱表达或不表达CDC25B蛋白。上述结果表明CDC25B1 和CDC25B2在四种胰腺癌细胞抹中过表达，而CDC25B3与胰腺癌关系尚不明 了。
技术实现思路
技术问题本专利技术提供一种表达人CDC25 B3质粒及其构建方法，该质粒转 染低表达CDC25B蛋白的肿瘤细胞可以使CDC25B蛋白高表达，可以用于探讨 CDC25B3基因的潜在致癌机制，在医学上具有重要的应用价值；同时本专利技术也 提供了该质粒的构建方法。我们希望通过构建CDC25B3的重组质粒，随后进行 体外实验，将质粒转染低表达CDC25B蛋白的胰腺癌细胞抹，观察转染前后细胞生物学行为发生的变化，探讨CDC25B3在胰腺癌发病过程中潜在机制。另外， 因为CDC25B在多种人类肿瘤中存在过度表达，我们可以利用上述方法，将此类 质粒用于其他人类肺瘤的研究上，以深入研究和阐明CDC25B基因在人类肿瘤发 生发展中所充当的角色。因此，本专利技术的应用不局限于胰腺癌，可广泛应用于 CDC25B在人类肿瘤的研究探讨上.技术方案本专利技术的技术解决方案为一种表达人CDC25 B3的质粒，该质粒 是含有CDC25B3的栽体pcDNA3.1(+)，其中CDC25B3具有SEQ ID NO:l所示的 核苷酸序列，可由pcDNA3.1(+)中的PCMV启动子表达。 一种构建权利要求1所 述质粒的方法，构建步骤为以CDC25B1的cDNA全长克隆IRATp970A0662D 为模板，PCR定向扩增剪切异构体CDC25B3的a片段和b片段；设计两对引 物引物1: 5-AGG GGC CCT CTA GAC TCG AGA TGG AGG TGC CCC AGC CG-3引物2: 5-TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCT CAC TTA TCG TCG TCA TCC TTG TAA TCC TGG TCC TGC AGC CGG CTA C陽3 引物3: 5-CAT GGC ATC TTG AAG AC A AAT CCA TCC GGC ATA GAC TGG AAG CGT C-3引物4: 5-GAC GCT TCC AGT CTA TGC CGG ATG GAT TTG TCT TCA AGA TGC CAT C-3以IRATp970A0662D为模板，用PCR方法，用引物1和3克隆CDC25B3的a片 段，引物2和4克隆CDC25B3的b片段；获得CDC25B3基因的CDS区全长 用PCR扩增的方法，用引物1和引物2对片段a和b进行拼结，得到CDC25B3 基因的CDS区全长；获得重组质粒pcDNA3.l-CDC25B3 :首先对质粒 pcDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人ＣＤＣ２５　Ｂ３的质粒，其特征在于该质粒是含有ＣＤＣ２５Ｂ３的载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋），其中ＣＤＣ２５Ｂ３具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的核苷酸序列，可由ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中的ＰＣＭＶ启动子表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：石欣，卫文俊，孔波，张齐，杨正平，肖志，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]