本发明专利技术公开了一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Ｂｍ－ｓｐ－ＨＡ－ｔｍ感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明专利技术提供了一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的ＨＡ融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过７５０ｋＤ中空纤维膜超滤后，再经ＨＰＬＣ和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一 种利用昆虫病毒出芽后分离获得细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法。
技术介绍
生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细 胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋 白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为 药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白 研究的"瓶颈"。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术提供一种细胞膜和细胞器膜蛋白分离与 纯化新的技术方法。本专利技术的一种通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后， 宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。所述的，依次包括 以下步骤(1 )重组杆状病毒Bm-sp-HA-tmlX106pFU/条针刺接种法感染昆虫宿主细 胞，培养5 — 7天，收获细胞；(2)将上述收获物在4t:下解冻后，与0. 85%生理盐水混和，匀浆； 3000rpm离心20-60min,取上清；6000rpm离心20-60min，取上清；12000rpm 离心30-120min，取上清；18000rpm离心30-120min,取上清；35000rpm离心30-90min; 35000rpm离心后，取上清，进行超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋 白。所述的昆虫宿主细胞为家蚕蛹。所述重组杆状病毒Bm-印-HA-tm的构建方法包括以下步骤(1) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物 Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ；Psp2: 5， catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc3，；(2) 以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物Ptml: 5' gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3， Ptm2: 5， gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3， ，(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物 Phal: 5， gaaaagaacgttactgttacacatgc 3，Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3，(4) 以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引物Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ； Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3，(5) 以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基因，所用引物Pspl: 5， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3， ，Ptm2: 5， gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3， ；(6) 将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细胞 E. coli DH5 a中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm;(7) 克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamH I和Not I双酶切切下sp-HA-tm融 合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转移 质粒pBacsp-HA-tm;(8) 取重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和经Bsu361酶切线性化的修饰 型病毒BmBacPAK6 DNA，加入无血清的TC-100培养基混匀，取Dosper加入无血清的TC-IOO培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100 培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm转移质粒和Dosper混合物，27°C 培养4-5天，取上清感染平皿中的Bm N细胞，1小时后弃去上清加入等量混合 的TC-100培养基和低熔点琼脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天， 保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合 基因作模板用随机引物探针标记试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感 染家蚕细胞扩增，即得到含sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。本专利技术的有益之处在于提供一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒 感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因 疏水作用而形成膜"小球"状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此 为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维 膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。本专利技术能促进膜蛋 白组学研究的发展，有助于发现药物蛋白作用的靶点，促进药物学、医学的发 展。说明书附图附图说明图1为本专利技术的实施例的质粒pGEM-sp-HA-tm; 图2为本专利技术的实施例的质粒pBac-sp-HA-tm。具体实施例方式下面结合实施例来说明本专利技术的技术方案 1.融合基因sp-HA-tm的构建。在HA基因(Genbank号DQ520855)的5，和3，端分别连接编码杆状病毒 囊膜蛋白gp64信号肽基因序列(Genbank号NP 074525)和gp64跨膜区基因 (Genbank号NP 074525)序列，并在融合基因的5，和3，端分别引入BamH I 和Not I酶切位点。分别以杆状病毒AcNPV gp64信号肽基因序列(Genbank号 NP 074525)、禽流感病毒H5N1 HA基因序列(Genbank号DQ520855)和gp64 跨膜区基因序列(Genbank号NP 074525)为模板设计3对引物，首先扩增目的片段gp64信号肽(sp) 、 HA和gp64跨膜域(tm)，然后利用各目的片段互为 引物和模板合成融合基因sp-HA-tm。设计引物如下-Pspl5，gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3'Psp25，catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcag犯tgcgccgccgcc 3'Phal5，gaaaagaacgttactgttacsicatgc 3'Pha25，aatgcaa^ttctgcattgt33cg3c 3'Ptml5，gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3'Ptm25，gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3'gp64信号肽(sp)的扩增以gp64 DNA (Genbank号NP 074525)为模板，PCR反应参数设计为，94°C 预变性3min, 94。C变性30s， 68。C复性延伸30s， 30个循环，68'C延伸5min。 在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10XPCR Buffer 10 p 125mmol本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，其特征在于：通过重组杆状病毒Ｂｍ－ｓｐ－ＨＡ－ｔｍ感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，陈健，吕正兵，吴祥甫，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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