本发明专利技术属于植物基因工程领域。从水稻中克隆到三个叶片衰老特异性诱导表达的启动子Ｐ↓［ＳＡＧ３９］、Ｐ↓［ＳＡＧ３９－１６００］和Ｐ↓［ＳＡＧ３９－４９３］，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示；所述启动子在成熟水稻叶片中有一定的表达，随着叶片衰老程度加深其表达量逐步变强，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点。本发明专利技术还公开了这三个启动子及其相应表达载体的制备方法，以及通过农杆菌介导的转基因方法导入水稻的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程和水稻分子育种
，具体涉及到一个叶片衰老特异诱导表达的水稻启 动子的克隆及其在转基因水稻中的应用。
技术介绍
水稻是人类最重要的粮食作物之一。虽然目前杂交稻的推广暂时解决了人类的粮食危机，但是目前生 产上广泛使用的一些优良杂交稻组合存在着一个重要的缺陷生育后期叶片易早衰，导致光合能力降低， 库大源不足，造成结实率低、充实度不良的问题。叶片是植物进行光合作用，吸收水和C02产生能量的重 要场所，也是植物体合成氨基酸、抗氧化剂、各种营养物质的工厂。 一旦叶片衰老，其光合能力将显著下 降，因而作物的产量很大程度上受到叶片衰老的影响。如果在生殖生长中后期，叶片能够保持较长时间的 健康持绿状态，能尽量持久地保持光合能力，并且增强它在籽粒充实期间的营养物质输出能力，改善籽粒 充实度，提高产量有重耍的意义。植物6身细胞核基W如何调控衰老进程，其中的分子机制尚不明确。传统的方法往叶片上喷洒激素如 细胞分裂素，或是在作物结实期适当追加氣肥，都可一定程度的延缓衰老。随着生物技术的发展，在培育 持绿性水稻的策略中，采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保护环境的措施。这主 要是基于激素生理学，运用转基因手段，增强细胞分裂素在植物体内表达来延缓衰老。细胞分裂素是植物 衰老调节研究最多的一种天然激素。细胞分裂素调控植物细胞分裂和分化，控制植物生长发育的多种进程，多:和芽的生长、营养信号的传导、增加作物产量等。细胞分裂素能够抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、 蛋白酶等的活性，能延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解并且促使营养物质向应用部位移动。异戊二烯合成酶基丙/iT编码调节细胞分裂素合成的关键限速酶，利用从根癌农杆菌中分离的//T基因，人们在叶片 抗衰老基因工程研究中开展了大量的工作，培育了一些持绿性植物(Smigocki, Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a reconstructed isopentenyl transferase gene. Plant Mol Biol, 1991, 16: 105-115i Li等,Genome-wide transcription analyses in rice using tiling microarrays. Nat Genet, 2006, 38: 124-129; Gan and Amasino, Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 1995， 270: 1966-1967; McKenzie, Controlled Cytokinin Production in Transgenic Tobacco Using a Copper-Inducible Promoter. Plant Physiol, 1998, 116: 969-977; Lin等,Cultivating rice with delaying leaf- senescence by PsAGn-ipt g^ne transformation. Acta Bot Sin, 2002, 44: 1333-1338; Cha.ng《f, Overproduction of Cytokinins in Petunia Flowers Transformed with Psagi2-IPT Delays CorollaSenescence and Decreases Sensitivity to Ethylene. Plant Physiol, 2003， 132: 2174-2183; Huynh 。， Regulation of flooding tolerance of SAG 12: ipt Arabidopsis plants by cytokinin. J Exp Bot, 2005, 56: 1397-1407 ;Calderini等，Delay of leaf senescence in Medicago sativa transformed with the ipt gene controlled by the senescence-specific promoter SAG 12. Plant Cell Reports, 2007, 26: 611-615)。 在这些研究中，早期利用的是表达量比较高的组成型启动子，如CaMV35S启动于或玉求Ubiquitin启动子， 结果显示组成型过量表达/尸r的转基因植株均表现为细胞分裂素含量增加，叶片衰老延迟，同时植株的生 长发育形态也发生了许多不正常的变化，如叶片变小、叶型变圆，顶端优势丧失，不能形成根或形成的根 不能伸长邻，后来利用热激启动子Phsp70和铜诱导型特异后动子，发现转基因植株的侧芽和叶片数都明 显增多。直到利用拟南芥衰老特异基因&4GU的启动子表达IPT转化烟草，取得了比较理想的效果，转基 因烟草叶片和花的衰老明显延迟，开花数提高60%，种子产量提高50%，生物学产量提高40%。转化拟 南芥、矮牵牛等同样达到延缓衰老的效果，开花数目亦有所增加，并且抗涝、抗旱性有所增强。但是该体 系在水稻这个禾本科植物中的应用受到物种差异的影响，只起到了持绿的效果，没有增加光合产物。找到 一个水稻来源的启动子在特定时期特定组织中高效特异的表达细胞分裂素将对培育持绿性高产水稻具有 重要作用和意义。计算机和网络技术的发展给生物信息学的研究注入新的活力，大量数据库的建立为启动子的预测及鉴 定带来方便，2008年建立了最新的真核启动子的数据库(Yamamoto and Obokata，卯db: a plant promoter database. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D977-981)。克隆启动子并通过报告基因来定性或定量的分析启动子 活性的技术很成熟。人们己经成功分离并验证了大量组成型或特异型表达的启动子，通过缺失分析、酵母 单杂交、凝胶阻滞实验、DNaseI足迹实验等技术鉴定了启动子DNA上反式作用蛋白结合的位点，探明一 批对组织或时空表达起调控作用的顺式作用元件(Khodakovskaya等，Enhanced cold tolerance in transgenic tobacco expressing a chloroplast w -3 fatty acid desaturase gene under the control of a cold-inducible promoter. Planta, 2006， 223: 1090-1100; Cai等,Identification of novel pathogen-responsive cis-elements and their binding proteins in the promoter of OsWRKY13， a gene regulating rice diseas本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种叶片衰老特异性表达的启动子Ｐ↓［ＳＡＧ３９］，它的核苷酸序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林拥军，刘莉，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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