实现高细胞密度发酵的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及悬浮动物或植物细胞系的高细胞密度连续培养方法，目的在于有效地生产生物制品。本发明专利技术也涉及到一些装置和仪器，在这些装置和仪器中，可以进行依照本发明专利技术来培养悬浮动物或植物细胞系的操作过程。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及培养悬浮动物或植物细胞系的连续方法，目的在于有效的生产生物制品。本专利技术也涉及一些装置和仪器，通过它们可实现按照本专利技术来培养悬浮动物或植物细胞系的方法。细胞培养对生物活性物质和药物活性产品的生产都非常重要。特别那些被频繁使用又自由地悬浮在营养培养基中的细胞的培养是困难和复杂的，因为它们与微生物和粘附的细胞不同，它们对机械应力和基质的不足供给都很敏感。出于这个原因，依照本专利技术所使用的装置仪器和技术方法对于有效的生产方法是至关重要的。在大多数培养悬浮动物或植物细胞系的技术方法中采用的是分批法。该方法存在缺点，即细胞计数和营养培养基和代谢物的浓度在数天或数周的批循环中不断变化，并且死细胞在发酵的后期聚积，形成的产物会发生酶降解或自发降解。因此连续的发酵过程是值得推荐的，特别对于不稳定活性化合物的生产。如果高细胞密度在发酵罐中能被实现并且相应可以获得高生产率，连续的方法是经济并有竞争力的。这需要(1)在发酵罐中有充足的氧供给来满足处于高细胞密度的细胞的高需氧量；(2)允许细胞有效保留的在反应器系统中细胞保留系统。(3)更可靠的长期操作，即稳定的操作条件(细胞，基质，代谢物和产物浓度)和整个反应器系统的长期无菌状态，和(4)一个稳固，简单和容易处理的方法。该方法必须也要考虑细胞对于机械应力和基质供给不足的高敏感性以及产物的不稳定性。在先的技术中描述了很多培养细胞系的仪器、装置和方法。以下装置和仪器的变体是已知的1、发酵罐细胞培养发酵罐经常选用的氧供给手段是通过多孔或扩散膜的无气泡氧供给方式，因为液体表面气泡的形成、上升和爆破使细胞经受高应力度。为此目的所推荐的搅拌器为相对较小的、高速的和轴向转运的搅拌器，其被安装在隔膜挡板中央(例如，Fenge，Fraune，Maier，1992.BioTec，452-54)。这样的反应器的设计是不利的，既因为高速、轴向转运的搅拌器会引起很高的应力度，也因为在容器壁和搅拌器之间的膜上的相对低速和相应低的氧传输率。这样一种反应器设计更合适，其中，通过安装的与整个隔膜高度相当并离它有一轻微距离的大搅拌器，加强了反应器中氧的运输。尽管由于在此种反应器的设计中使用的挡板，使得只能使用相对小的隔膜挡板和相应小的传质表面。由于按比例扩大该方法时，膜的表面面积与反应器体积的比与反应器的直径成反比，因此上述的氧供给方法只适用于小反应器或低细胞密度。而且，采取大气泡充气的方法进行氧供给，用搅拌的方法使气泡分散，这都限制了细胞密度和细胞培养的存活率，因为涉及到巨大的机械应力强度。2、细胞保留对于连续的发酵过程，在过去许多不同的细胞保留系统被建议采用，为了允许灵活处理，其被适当安装在发酵罐的外部。当使用外部装置时，特别是在对细胞的氧供给不足和发酵罐外CO2去除不充分时，为了最小化发生的细胞损伤，特别需要操作体积小并且细胞在其中停留时间相对较短的细胞保留系统。除了膜滤器和带有固定和移动薄膜的交叉流动过滤装置外，也用到了专用离心机和沉降装置。然而在通过膜滤器发生细胞保留的地方，观察到了积垢效应，由此致使不可能进行稳固的低维修要求的长期操作。通过在膜上的高流速可获得积垢的减少。但由于在膜装置的泵、管道和通道中的高流速产生了增加的应力，所以对高流速的需要是细胞低剪切处理所不允许的。为了用离心分离的方法移去细胞，开发了专用的离心机，但它们的缺点是使细胞经受增加的机械应力，因为用来移去的加速度是重力加速度的二百倍以上。另外，如果没有维修保养，离心机不会安全运转超过几周或几个月，并且也会导致操作成本增加。还有一种将细胞从细胞培养上清液中移去的手段就是用重力沉降装置。在细胞培养中主要应用的重力沉降装置是沉积槽和倾斜通道系统。与简单的沉降容器相比，倾斜通道系统具有容积显著更小的优点。迄今为止所描述过的系统(J.Stevens，u.a.PreprintEsact-Meeting 1993Würzburg；K.J.Thompson，J.S.WilsonPreprint Esact-Meeting 1993Würzburg；J.A.Searles，u.a.Biotechnol.Prog.1994，10，188-206；WO 94/26384)是具有很小的沉降面积的逆流系统(Ath＝zb1L cosα＜0.2m2；z板数；b1宽；L通道长度；α与水平线之间的倾角)，因此不能用于生产规模。逆流倾斜通道系统中的是按比例放大是个难题，因为在发酵罐体积V增大时，沉降分离器所要求的浓缩物和清液相的收集室的体积，VSF，会超比例地增大(灌注速率恒定时，VSFαV1.5)，在灌注速率q/V增加时甚至还要增大更多(恒定的发酵罐体积时，VSFα(q/V)2.15)。由于不利的几何形状(流入和流出部分及通道长度)并造成大的操作体积，大多数建议用于细胞培养的倾斜通道系统的几何形状确实阻止它们用于大规模设备。在建议的变体中，引入其中的浓缩物和清液相的收集室以及流入和流出的通道被不利地设计。采用的倾斜通道系统的通道长度相对比较短，范围在100到300mm之间。最常被建议的长度只有100mm。然而对于已知使用这些系统的用户，所建议的变体的特征没有证实是负面的，因为仅是对小规模(发酵罐体积1-25L)系统进行了试验。对于高细胞浓度发酵，用高于1.5×107活细胞每毫升反应器体积的细胞浓度，如果采用常规的沉降器设计，对于容积为100到200L的发酵罐，则必须要有体积为70到550L或50到500L的沉降分离器(即使用可相对快速沉降的BHK细胞)。在这样的装置中并经历较长的周期也不能获得所期望的1.5×107活细胞每毫升反应器体积的细胞密度，因为由于在沉降分离器中停留时间长并且相应供氧量不充分而不能维持优选的μ≈0.4/d的生长率。尽管Bayer AG的公报(1992，Chemie-Technik，21(3)，118)中包含了关于0.2到2.5米的长倾斜通道系统的参考内容，但此论文所描述的液体分布系统和浓缩物收集室不能满足关于操作体积小的要求。由于这样的事实，即在所公开的装置中，培养基是被注射到杯状装置中(为了减小在接收室(32)中的湍流)，接收室(32)本身的体积必须相对较大。事实上，不可能构造这样一个带有杯状装置又具有完全圆锥或金字塔几何形状的接收室。为了将这个杯状装置放进接收室中，除了圆锥形或金字塔形的截面，接收室必须具有圆柱形截面，因此接收室的体积增加了。在上述例子中，沉降分离器的工作体积是Vs＝50到100L，这远高于本专利技术中分离器的体积。2.1冷却为了降低沉降分离器中代谢的活性和细胞的沉降物，建议对沉降分离器中的细胞培养液进行冷却。由于在沉降分离器的内部有温度梯度(以及对应的密度梯度)形成，这个基本上正确的建议确实仍导致了对流。这反过来对细胞分离的有效性有负面影响。这一点对使用分离器表面积和分离器体积的比例相对较低的分离器时是至关重要的，因为在这样的装置中，每单位分离器体积仅能获得相对较小容积的生产量。2.2振动为了减少细胞在沉降分离器中的停留时间，建议对倾斜通道系统采用不规律振动(Bayer AG，1992，Chemie-Technik，21(3)118；Searles，等1994.Biotechnology P本文档来自技高网...

【技术保护点】
实现连续高细胞密度发酵的装置，该装置包括预培养发酵罐（９）、基质储存罐（１）、生产发酵罐（２）和沉降分离器，其特征在于沉降分离器的基于分离器体积的分离器表面面积为Ａ↓［ｔｈ］／Ｖ↓［ｓ］≥３０ｍ↑［２］／ｍ↑［３］。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HJ亨茨勒，J考林，F施密特，E贝克尔斯，B贝德克尔，H冯胡戈，K孔斯坦蒂诺夫，D纳维，U施泰纳，
申请(专利权)人：拜耳医药保健股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]