用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一组用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记，是具有序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示碱基序列的一组微卫星标记。本发明专利技术提供的一组六碱基重复基序分子标记可以应用于检测黍子的遗传差异，进行黍子种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究和分子标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

For the six nucleotide repeat motifs between molecular marker genetic detection of millet

The invention discloses a group for six nucleotide repeat motifs of molecular markers in genetic testing is the difference of millet, with SEQ ID sequence table No.1 ~ SEQ ID No.4 the base sequence of a set of microsatellite markers. The genetic differences between a group of six nucleotide repeat motifs of molecular markers provided by the invention can be applied to the detection of millet, millet genetic diversity of germplasm resources evaluation, millet crop evolution and molecular marker assisted breeding, good repeatability, is a reliable and effective molecular marker.

【技术实现步骤摘要】
用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记
本专利技术属于分子生物遗传标记
，涉及用于检测黍子遗传差异的分子标记，特别是含有六碱基重复基序的分子标记。
技术介绍
黍子(PanicummiliaceumL.)，起源于中国黄河流域，是世界上最早驯化的栽培作物之一。黍子抗旱耐瘠，生育期短，是北方冷凉地区的特色物种。目前全球气温日益增高，培育筛选抗旱作物势在必行。黍子环境适应性强，搞清黍子的遗传背景，是有效利用黍子的前提。分子标记能从DNA水平上揭示黍子的遗传多样性，是分子标记辅助育种的关键。微卫星标记以简单序列重复为特点，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复等。虽然现有报道检测黍子遗传差异的DNA标记较多，但微卫星标记欠缺且多来自于种间。由于黍子特异性SSR标记不多，且多为三碱基重复单元，四核苷酸重复基元较少，六碱基重复基元尚缺，导致黍子遗传图谱构建受限，黍子优异基因难以通过基因工程手段在大宗作物遗传改良中发挥作用。因此，有必要开发挖掘六碱基重复序列，利用这些功能基因组元件，有效实现大宗作物的抗旱耐盐性遗传改良。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一组用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记，利用这些分子标记可以进行黍子种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究和分子标记辅助育种。提供用于检测所述分子标记的引物对，是本专利技术的另一专利技术目的。本专利技术所述的一组用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记是具有序列表SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示碱基序列的一组微卫星标记，微卫星标记编号分别为RYW1、RYW2、RYW3和RYW4。其中RYW1为636个核苷酸，具有6次重复的六碱基重复基序(TCATCT)6，RYW2为330个核苷酸，具有5次重复的六碱基重复基序(CGAAGC)5，RYW3为562个核苷酸，具有5次重复的六碱基重复基序(CTGCAA)5，RYW4为473个核苷酸，具有5次重复的六碱基重复基序(GTGCCG)5。进而，本专利技术所述的分子标记分别由各自的引物对扩增得到。其中，用于扩增RYW1的引物对具有序列表SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的碱基序列，用于扩增RYW2的引物对具有序列表SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的碱基序列，用于扩增RYW3的引物对具有序列表SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的碱基序列，用于扩增RYW4的引物对具有序列表SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的碱基序列。本专利技术通过黍子六碱基核苷酸重复序列mRNA富集文库构建和含六碱基核苷酸重复序列测序，得到了一组4个六碱基核苷酸重复序列，开发确定了4个多态性丰富的黍子六碱基重复基序微卫星标记RYW1、RYW2、RYW3和RYW4，以及用于扩增该4个六碱基重复基序位点的专用引物。本专利技术上述提供的一组六碱基重复基序分子标记可以应用于检测黍子的遗传差异。具体地，本专利技术所述一组六碱基重复基序分子标记可以在黍子种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究、分子标记辅助育种等方面得到应用。以本专利技术所述一组4个多态性丰富的黍子六碱基重复基序分子标记进行黍子种质资源遗传多样性评估、黍子作物进化研究和分子标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。本专利技术开发的六碱基重复基序分子标记用于检测来源于不同生态区的黍子种质时，条带清晰，重复性好，多态性高，是黍子特异性的微卫星标记。本专利技术选取来源于不同生态栽培区的96份黍子种植资源，以本专利技术上述四对引物扩增多态性，发现平均每对引物检测到的等位基因数为3个，检测效果显著。其中，多态性信息含量0.57，多样性指数0.82，均高于以往研究结果(最高分别为0.49和0.53)。说明黍子遗传多样性丰富，本专利技术提供的检测用分子标记是有效的评估工具。附图说明图1是以本专利技术一组4个六碱基重复基序分子标记扩增6个黍子品种的电泳图。具体实施方式实施例1。在温室中分别种植抗盐性差异显著的两个黍子品种：耐盐品种287(统一编号00002661)和盐敏感品种老糜子(统一编号00005435)。剪取三叶期叶片组织，用Trizolpluskit(ThermoFisher，USA)试剂盒提取总RNA。用NEBNextPoly(A)mRNAMagneticIsolationModule(NEB，E7490)富集mRNA，以mRNA为模板，用NEBNextmRNALibraryPrepMasterMixSetforIllumina(NEB，E6110)和NEBNextMultiplexOligosforIllumina(NEB，E7500)构建上机文库。制备好的文库用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小，用LibraryQuantificationKit-IlluminaGAUniversal(Kapa，KK4824)进行QPCR定量。检测合格的文库在Illuminacbot上进行簇的生成，最后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。利用denovo组装转录本，共获得54880条Unigene。利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件对筛选得到的1kb以上的Unigene做SSR分析，与NCBI数据库中的单子叶植物谷子、柳枝稷等的基因组序列进行比对，共筛选获得4个含有六碱基核苷酸重复序列的Unigene，分别标记为RYW1、RYW2、RYW3和RYW4，重复基序分别为(TCATCT)6、(CGAAGC)5、(CTGCAA)5、(GTGCCG)5，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示。利用Primer5.0针对上述4个六碱基核苷酸重复序列设计前、后引物，引物设计参数见表1，引物对合成送上海生工生物工程技术服务有限公司。以下给出了RYW1、RYW2、RYW3和RYW4四个位点的具体引物序列。RYW1-F：5'-TAACGCTTCACCTTCAGACC-3'。RYW1-R：5'-TGAGATGGAGTTGGCTGATG-3'。RYW2-F：5'-TTAGGGCTCTCCTGCATCC-3'。RYW2-R：5'-CAGCGAGTTCACCGTCAAG-3'。RYW3-F：5'-GGAGGCGTGACAATAAAAC-3'。RYW3-R：5'-GGCGTGAGGTGTTGTTTTT-3'。RYW4-F：5'-AATCCACAACGCACACGAC-3'。RYW4-R：5'-ATTTGCTCCTCTCGTCGGT-3'。实施例2。以来源于不同生态区的6个黍子品种(表2)为试材，分析四个SSR标记的引物特征(等位变异大小和引物分辨率/Rp值)。将所述6个试材种植在营养钵中，于三叶期剪取幼苗叶片，以改良CTAB法提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA质量，紫外微量核酸仪测定DNA的纯度和浓度。以LifeEco基因扩增仪(TC-96/G/H(b)c，杭州博日科技有限公司)对上述DNA序列进行PCR扩增。PCR反应体系：10×buffer(含25mmol/LMg2+)2μL，10mmol/LdNTP1.8μL，5U/LTaq聚合酶0.4μL，1mmol/L前后引物各0.6μL，ddH2O13.6μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记，是具有序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示碱基序列的一组微卫星标记，微卫星标记编号分别为RYW1、RYW2、RYW3和RYW4。

【技术特征摘要】
1.用于检测黍子遗传差异的六碱基重复基序分子标记，是具有序列表SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示碱基序列的一组微卫星标记，微卫星标记编号分别为RYW1、RYW2、RYW3和RYW4。2.用于检测权利要求1所述六碱基重复基序分子标记的引物，其特征是用于扩增RYW1的引物对具有序列表SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的碱基序列，用于扩增RYW2的引物对具有序列表SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的碱基序列，用于扩增RYW3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞云，石甜甜，薛延桃，何杰丽，刘笑瑜，王璐琳，乔治军，王海岗，陈凌，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14