本发明专利技术公开了一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1‑FEH III及其编码的蛋白和应用。一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1‑FEH III，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的菊芋果聚糖外切水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从菊芋中克隆到一个新的果聚糖外切水解酶基因1‑FEH III，该基因编码的果聚糖外切水解酶有别于已报到的果聚糖外切水解酶不具水解蔗糖能力或水解蔗糖能力极弱，具有较强的水解蔗糖的能力。同时Ht1‑FEH III还有较弱的水解利云型果聚糖的能力即水解β(2,6)键的能力。可见，Ht1‑FEH III不是普通的FEH，它可能是一种新型的果聚糖外切水解酶。
Application of a protein and fructan hydrolase gene of Jerusalem artichoke cut 1 FEH III and its encoding
Protein and the application of the invention discloses a fructan hydrolase gene of Jerusalem artichoke cut 1 FEH III and its encoding. A cut of Jerusalem artichoke fructan hydrolase gene FEH 1 III, which is characterized in that the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. The gene encoding the artichoke fructan exo hydrolase, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The present invention from Jerusalem artichoke cloned a new cut fructan hydrolase gene 1 FEH III, the gene encoding fructan hydrolase cut is different from the reported fructosan hydrolase with exo hydrolysis of sucrose hydrolysis of sucrose or very weak ability, has the strong ability of sucrose hydrolysis. At the same time, Ht1 FEH and III weak hydrolysis levan type fructans (2,6) hydrolysis ability of beta key ability. Therefore, Ht1 FEH III than ordinary FEH, it may be a new type of fructan exo hydrolase.
【技术实现步骤摘要】
一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII及其编码的蛋白和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII及其编码的蛋白和应用。
技术介绍
果聚糖外切水解酶(FEHs)在植物体内参与果聚糖的水解，不仅为植物提供了生长所需要的养分，还在逆境条件下保护植物不受胁迫的影响。近年来，植物中的FEH被相继发现，1-FEHs(可以水解β(2,1)连接的果聚糖)cDNAs序列相继从菊苣、多年生黑麦草和无芒雀麦叶片中克隆出来(VandenEndeetal.2000)(Lothieretal.2007；DelVisoetal.2009)。6-FEHs(可以水解β(2,6)连接的果聚糖)的cDNA在猫尾草(Tamuraetal.2011、小麦(VanRietetal.2006)中筛选和克隆出来。另外两种类型6&1-FEHs(Kawakamietal.2005)和6-KEHs(VandenEndeetal.2005)也已经在小麦中被克隆出来，前者能够降解β(2,1)和β(2,6)而后者则水解特异性底物6-蔗果三糖。不仅如此，1-FEHs和6-FEHs也从非果聚糖积累植物如拟南芥(Deconinck,Betal.2005)和甜菜(VandenEndeetal.2003)中得到克隆和纯化。菊芋属于典型的果聚糖植物，本课题组的许欢欢从菊芋块茎中克隆出两个果聚糖外切水解酶Ht1-FEHI和Ht1-FEHII(许欢欢，2015)，而张茜通过与果聚糖水解酶基因和菊芋转录组的测序结果分析，推测菊芋中可能还存在一条果聚糖外切水解酶基因，通过软件拼接出这条基因序列，并对其进行克隆及功能鉴定，但是构建的载体转入酵母后没有发现酶活(张茜，2016)。我们再经过比对发现是因为少扩增了200bp的序列。在目前的研究报道中很少有果聚糖外切水解酶对蔗糖有较高的水解能力。小麦的1-FEHw1和w2只显示出来微小的蔗糖转化酶能力(VandenEnde.2003)，梯牧草中提取的1-FEHI也具有很弱的蔗糖转化酶的能力(KeijiUeno1etal.2011)。从甜菜中克隆的6-FEH同样对蔗糖的水解能力也很弱或者没有(VandenEndeetal.2003)。小麦的6&1-FEHs对蔗糖几乎没有水解能力(Kawakamietal.2005)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII。本专利技术的另一目的是提供该基因编码的蛋白。本专利技术的又一目的是提供该基因和蛋白的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述的菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII编码的菊芋果聚糖外切水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有权利要求1所述的菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII的重组表达载体。本专利技术所述的菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII在水解蔗糖中的应用。本专利技术所述的菊芋果聚糖外切水解酶在水解蔗糖中的应用。有益效果：本专利技术从菊芋中克隆到一个新的果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII，该基因编码的果聚糖外切水解酶有别于已报到的果聚糖外切水解酶不具水解蔗糖能力或水解蔗糖能力极弱，具有较强的水解蔗糖的能力。同时Ht1-FEHIII还有较弱的水解梯牧草型果聚糖的能力即水解β(2,6)键的能力。在添加了同时添加了蔗糖和蔗果三糖的溶液中，一般的1-FEH对蔗果三糖的降解能力显著降低，而且随着蔗糖浓度的升高，降低的越明显(Xuhuanhuanet.al.,2015)。但是Ht1-FEHIII却不一样。随着蔗糖浓度的升高，Ht1-FEHIII降解蔗果三糖的能力却得到了提高，由此可见，Ht1-FEHIII不是普通的1-FEH，它可能是一种新型的果聚糖外切水解酶。附图说明图1Ht1-FEHIII的CDS扩增图2Ht1-FEHIII氨基酸序列与其他植物的FEH等的发育进化树注：Ta：小麦；Bp：雀麦；Lp：黑麦草；Pp：猫尾草；Vh：斑鸠菊；Ci：菊苣；Ht：菊芋；At：拟南芥。编号表示NCBI的基因登录号。图3表达载体的构建注：M1：2000bp；M2：5000bp；A：添加酶切位点的Ht1-FEHIII；B：Ht1-FEHIII的双酶切；C：pPiczαC空载的双酶切图4果聚糖外切酶的线性化M：15000bpDNAMarker，A：pPiczαC–FEHIII线性化后；B：pPiczαC–FEHIII线性化前图5酵母阳性转化子的验证注：M1:2000bpDNAMarker；A:Ht1-FEHIII图6重组蛋白的SDS-PAGE图7Ht1-FEHIII的最适pH图8Ht1-FEHIII的最适温度具体实施方式实施例1菊芋Ht1-FEHIII的克隆以上游引物引物ATGATGAAGATTTATGGGTTTTG(SEQIDNO.3)和下游引物TTATATAATAGGCTTTCTTC(SEQIDNO.4)和菊芋块茎的cDNA(mRNA反转录)为模板和普通Taq酶(CW康为公司)进行PCR扩增，反应体系如下：扩增产物跑胶照胶并切下对应大小的条带回收，连接载体PMd-19后转大肠杆菌送测序，测序正确后用提取质粒试剂盒(CW康为公司)提取质粒，所有操作步骤参照说明书进行。根据菊芋数据库的预测，拼接出来的Ht1-FEHIII基因大小为1719bp。以cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，扩增出一条大小在1500-2000bp的条带，与从菊芋转录组数据库中的拼接出来的基因大小符合，如图1。切下条带回收，连接载体转大肠后测序，把测序结果和拼接序列进行比对发现一致。利用软件Megalign将Ht1-FEHIII的氨基酸序列与不同FEHs和INVs等比对后做出的树形图如图2，从图中可以看出，Ht1-FEHIII与Ci1-FEHI和Ht1-FEHI最为相似，它们之间的相似度分别达到了65.9％和61.1％；Ht1-FEHIII与Ht1-FEHII的相似度只有54.9％；Ht1-FEHIII与At6&1-FEH通过序列对比，它们的相似度达到了53％；与At6-FEH比对，有54.6％的相似部分；Ht1-FEHIII与Ci1-FEHIIA和Ci1-FEHIIB的相似程度分别是54.6％和53.9％。对于与合成果聚糖的基因Ht1-SST和Ht1-FFT相比，它们的相似度分别是40.8％和40.9％。而通过比较，与蔗糖转化酶基因序列进行比对分析，Ht1-FEHIII与AtcwINV1的相似度为53.4％，与CivacINV的相似度为46.2％。实施例22.1表达载体的构建利用pPiczαC作为载体，因其上带有6xHIS标签，能在毕赤酵母中表达并在纯化阶段挂上亲和Ni+柱从而达到纯化目的。Ht1-FEHIII通过高保真酶(TaKaRa)扩增，以上述克隆的Ht1-FEHIII进行PCR扩增在基因两端添加酶切位点XhoI/NotI(图3左图)，连接pEASY-Blunt(TransGen)载体转化挑选阳性克隆测序，测序正确后提取质粒进行双酶切(图3右图)，为了让目的基因与pPiczαC载体连接，pPiczαC也本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1‑FEH III，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的菊芋果聚糖外切水解酶基因1-FEHIII编码的菊芋果聚糖外切水解酶。3.含有权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁明祥，詹文悦，张茜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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