基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法制造技术

本发明专利技术属于分析化学及生物技术领域，涉及一种基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法。本发明专利技术方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中甲胎蛋白含量，灵敏度可以达到0.007ng/mL，检测线性范围达0.05‑12ng/mL，具有很好的应用前景。

Hypersensitive detection of alpha fetoprotein based on the signal amplification of porous ZnS nanospheres

The invention belongs to the field of analytical chemistry and biotechnology, and relates to a colorimetric analysis method of ultra sensitive detection of alpha fetoprotein based on signal amplification of porous ZnS nanospheres. The method of the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, good stability, can be used for detection of serum or plasma alpha fetoprotein, sensitivity can reach 0.007ng/mL, the linear range of detection was 0.05 12ng/mL, has good application prospects.

【技术实现步骤摘要】
基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法
本专利技术属于分析化学及生物
，涉及一种基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法。
技术介绍
甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，也是一种致癌糖蛋白，作为一种成人生理状态的分子标记，在健康的成人体内，其值通常低于25ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测主要有酶联免疫分析法、放射免疫测定法、间接血酶法和琼脂双扩散法等，虽然这些方法灵敏、可靠，但存在酶不稳定，放射物质设备要求高、危害较大这些缺点，适用范围也各有不同。如何建立灵敏、特异的检测甲胎蛋白的方法是需要急需解决的一个难点问题，而结合纳米材料设计一种新型探针，进行AFP的快速、灵敏检测引起广泛关注。多种基于纳米材料的检测方法已经报道，包括电化学方法[X.X.Ge，A.D.Zhang，Y.H.Lin，D.Du，BiosensorsandBioelectronics.2016，80，201-207；H.Wang，G.H.Li，Y.H.Zhang，M.Zhu，H.M.Ma，B.Du，Q.Wei，Y.K.Wan，AnalyticalChemistry，2015，87(22)，11209-11214.]、化学发光法[C.Cui，Y.Chen，D.C.Jiang，J.-J.Zhu，H.-Y.Chen.AnalyticalChemistry.2017，89(4)，2418-2423]、荧光分析[J.Cao，W.Wang，B.Bo，X.Mao，K.Wang，X.Zhu，BiosensBioelectron.2017，90，534-541]等。然而这些方法需要复杂的多步操作过程、精巧的实验技巧，不利于多次、大量开展甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)的检测。我们开发的基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏甲胎蛋白的比色分析法，首先在96孔板上捕获抗体1，然后捕获检测目标抗原-甲胎蛋白，最后将标记有多孔ZnS纳米微球的检测抗体与目标抗原反应，洗涤后，加入酸使得多孔ZnS纳米微球溶解，最后加入锌变色试剂2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠盐(Nitro-PAPS)，通过溶液在571nm的OD值检测其抗原-甲胎蛋白的浓度。其检测限可达到0.007ng/mL。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析方法。本专利技术的技术方案，基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析方法，包括多孔ZnS纳米微球的合成及表征，多孔ZnS纳米微球标记检测抗体，用标记过的多孔ZnS纳米微球检测甲胎蛋白。具体步骤如下：(1)多孔ZnS纳米微球的合成a.多孔硫化锌纳米微球制备；b.多孔硫化锌纳米微球的巯基官能团化：将多孔硫化锌纳米微球分散于无水乙醇中，加入DL-二硫苏糖醇，使得多孔硫化锌纳米微球与DL-二硫苏糖醇的质量比为3∶1～1∶3，且多孔硫化锌纳米微球的质量浓度为5mg/mL～10mg/mL，强力搅拌后通氮气半小时排出空气，然后在通氮气作用下于15～35℃条件下反应15～24小时，反应完成后离心分离2min。然后多次用无水乙醇洗涤沉淀物，真空干燥，得干燥后的巯基化的多孔硫化锌纳米微球；(2)多孔ZnS纳米微球与抗体的偶联：a.取上述制备得到的0.5～5mg/ml巯基官能团化的多孔ZnS纳米微球0.2～1ml，加入2～6mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1～4mg，在室温下振荡30～60分钟，然后将100～250μL的20μg/ml抗体溶液加入上述溶液中，室温反应12～24小时。反应完毕，超滤离心去除反应副产物以及没有反应完毕的抗体。b.把上述偶联后的多孔ZnS纳米微球加入重量体积比0.2～1％牛血清白蛋白BSA封闭纳米微球表面的剩余反应活性位点，然后加入重量体积比5～10％蔗糖、重量体积比0.1～0.3％PEG8000、重量体积比5～10％甘油的pH值7.4的磷酸盐缓冲液重悬，保持溶液pH值为7.4。(3)甲胎蛋白的捕捉：首先用(100mM，pH9.6)碳酸钠缓冲液稀释抗-AFP(Ab1)抗体浓度为2～8μg/mL，在96孔板中加入上述80～200μL抗-AFP抗体(Ab1)溶液，4℃过夜。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤5次后，用150～300μL的1％BSA溶液反应1～3小时以封闭活性位点。然后用PBS缓冲液洗涤5次后，然后加入80～200μL甲胎蛋白样本溶液。随后，上述96孔板在37℃下孵育反应30～90分钟，再次用PBS缓冲液洗涤5次后，加入80～200μL上述抗体偶联的多孔ZnS纳米微球溶液，在37℃下孵育反应30～60分钟，随后用PBS缓冲溶液洗涤5次。(4)甲胎蛋白比色法检测：在上述反应完毕后的96孔板中的每个孔中加入0.1M的硝酸溶液50～200μL，在混旋仪上混旋30分钟。用3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH8.1。然后50～200μL的TritonX-100/SDS溶液加入到每个孔中混旋3～6分钟；然后，30～100μL的Nitro-PAPS(0.1mmol/l)溶液添加到每个孔中，混旋10分钟后，在酶标仪上571nm波长下测定OD值。计算方法：5点定标法，以样品函数为计算模式，根据酶标仪OD值与参考样品甲胎蛋白的值做工作曲线，样品含量可根据其OD值在工作曲线上算出。本专利技术基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法具有以下优点：(1)、本专利技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中甲胎蛋白含量，灵敏度可以达到0.007ng/mL，检测线性范围达0.05-12ng/mL。(2)、本专利技术制造成本低，具有较大的市场竞争力。附图说明图1为多孔ZnS纳米微球的SEM及TEM图；图2为基于多孔ZnS纳米微球对甲胎蛋白检测结果示意图；图3为基于多孔ZnS纳米微球对甲胎蛋白检测结果-线性关系图；具体实施方式以下通过实施例形式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。下面结合附图，通过具体实施例对本专利技术进一步详述。实施例1：多孔ZnS纳米微球的制备实验材料：二水醋酸锌，批号为：MFCD00066961，购自上海阿拉丁试剂有限公司；阿拉伯胶粉，批号为20120825，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硫代乙酰胺，批号为：20010619，购自南京化学试剂有限公司；β-巯基乙胺，批号为：MFCD00012904，购自上海生工生物工程有限公司；二甲基甲酰胺，批号为：F20061110，购自南京化学试剂有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。实验仪器及设备：圆底烧瓶、KQ-500DE超声波清洗器、聚四氟乙烯反应釜、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、DF-101S磁力加热搅拌器、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。实验过程：(1)原始多孔硫化锌纳米微球的制备1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法，其特征在于捕获甲胎蛋白的多孔ZnS纳米微球经过酸溶解、加入显色剂2‑(5‑硝基‑2‑吡啶偶氮)‑5‑[N‑正丙基‑N‑(3‑磺酸丙基)氨基]苯酚二钠盐(Nitro‑PAPS)显色检测甲胎蛋白。具体步骤如下：在经过捕获甲胎蛋白的过程后，留有多孔ZnS纳米微球的96孔板中的每个孔中加入0.1M的硝酸溶液50～200μL，在混旋仪上混旋30分钟。用3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH8.1。然后，50～200μL的聚乙二醇辛基苯基醚‑100(Triton X‑100)/十二烷基硫酸钠(SDS)溶液加入到每个孔中混旋3～6分钟；30～100μL的Nitro‑PAPS(0.1mmol/l)溶液添加到每个孔中，混旋10分钟后，在酶标仪上571nm波长下测定OD值。根据酶标仪OD值与参考样品甲胎蛋白的值做工作曲线，样品含量可根据其OD值在工作曲线上算出。

【技术特征摘要】
1.基于多孔ZnS纳米微球信号放大的超灵敏检测甲胎蛋白的比色分析法，其特征在于捕获甲胎蛋白的多孔ZnS纳米微球经过酸溶解、加入显色剂2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠盐(Nitro-PAPS)显色检测甲胎蛋白。具体步骤如下：在经过捕获甲胎蛋白的过程后，留有多孔ZnS纳米微球的96孔板中的每个孔中加入0.1M的硝酸溶液50～200μL，在混旋仪上混旋30分钟。用3M的氢氧化钠溶液调节溶液pH8.1。然后，50～200μL的聚乙二醇辛基苯基醚...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱栋，缪赵怡，胡玥，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32