本发明专利技术涉及引发2型糖尿病的胰岛素灵敏度降低早期诊断生物标志物‑galectin‑3(Gal‑3)的血液浓度水平检测的电化学传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。其特征在于：首先分别合成N‑GNRs‑Fe‑MOFs@AuPNs传感器基底修饰纳米复合材料和AuPt‑MB纳米复合信号材料，再将能与Gal‑3特异性结合检测抗体与AuPt‑MB复合材料混合，制得生物信号探针。然后在N‑GNRs‑Fe‑MOFs@AuPNs复合材料修饰的基底平台上接合Gal‑3特异性捕获抗体，以便于特异性捕获目标物Gal‑3。最后通过Gal‑3与其检测抗体和捕获抗体的特异性结合，制备得到了Gal‑3的血液浓度水平检测的电化学传感器，该传感器成功的用于血清中Gal‑3的检测。本发明专利技术的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，方便。本发明专利技术为引发2型糖尿病的胰岛素抵抗提供早期的诊断依据。
【技术实现步骤摘要】
一种用于血清中galectin-3浓度检测的电化学传感器制备方法
：本专利技术涉及引发2型糖尿病的胰岛素灵敏度降低早期诊断生物标志物-galectin-3(Gal-3)的血液浓度水平检测的电化学传感器的制备方法及应用，尤其是基于AuPt-MB纳米复合材料作为新型信号探针制备的夹心型免疫生物传感器，用于血清中galectin-3(Gal-3)浓度检测，属于电化学检测领域。
技术介绍
：糖尿病在全球范围内迅速增长，对人类健康已构成严重威胁。特别是由胰岛素灵敏度降低引起的2型糖尿病(T2D)能够导致致死性的心血管并发症，并占据糖尿病患病率的90％。在最近的研究中发现，galectin-3(Gal-3)能直接与胰岛素受体结合抑制下游胰岛素受体(IR)信号传导和链接炎症降低胰岛素敏感性，最终导致胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受，引发2型糖尿病。因此，监测血液中Gal-3浓度水平的变化，对预防T2D及其心血管并发症尤为重要。在目前对Gal-3进行检测的主要传统方法有：酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫组化和“常规Gal-3”测定(雅培诊断)。然而，这些传统方法相对存在着昂贵，费时，半定量，需要熟练的操作者，灵敏度有限和线性范围窄等缺点的限制。特别是不能满足早期检测的临床需求。因此，探索研究一种用于Gal-3的简便，快速和灵敏的检测方法显得格外重要。与传统的检测方法相比，电化学免疫传生物感器检测方法因其具有灵敏度高，特异性强和快速检测等优点，近年来在临床蛋白生物标志物检测方面越来越受到重视。同时，基于纳米材料的电化学生物传感器由于简便，快速，成本低，灵敏度高等优势而被广泛应用于生物样品的检测。因此，基于纳米复合材料构建一种夹心式电化学免疫生物传感器为实现血清中Gal-3的低浓度高灵敏检测提供了一种新思路。亚甲基蓝(MB)是一种吩噻嗪染料的衍生物，由于其结构中存在富含电子的硫和氮杂原子作为一种新兴的电化学氧化还原活性物质被广泛用地应用于催化、感测和氧化还原指示等领域。然而，由于其不均匀的形态使其在免疫传感器信号探针方面的应用收到限制。为解决这一问题，本专利技术创新性地引入了具有比表面积大、导电性强和生物分子兼容性好AuPt双金属纳米材料与MB发生氧化聚合反应，得到了具有均匀棒状形态AuPt-MB纳米复合材料，并且显示出显著的电化学活性。在本专利技术中将AuPt-MB纳米复合材料与Gal-3特异性检测抗体Ab2结合，并用BSA做封闭剂制备得到新型纳米信号探针。为了进一步增加本夹心型免疫传感器的灵敏度和稳定性。引入了一种新型的纳米复合材料氮参杂石墨烯纳米带(N-GNRs)-铁金属有机框架(Fe-MOFs)-金纳米粒(AuNPs)-(N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs)作为传感器基底修饰材料。金属-有机骨架(MOFs)是一种类沸石状结晶多孔材料，它们具有较大的表面积，灵活的孔隙率，易于定制组合成分和活性位点多等优点，作为新型多功能材料，它们已被广泛地用于储气/分离，催化和传感等领域。本专利技术中引入的Fe-MOFs具有稳定性好、比表面积大和低毒性等特点。因其具有很大的比表面积可以通过Au-N化学键在其表面结合大量的AuNPs纳米粒增加其导电性，同时有助于下步固载结合Gal-3特异性捕获抗体Ab1。为了进一步增加导电性，将N-GNRs与Fe-MOFs@AuNPs混合反应得到N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料。N-GNRs由广泛用于提高改性电极表面的导电性能的N掺杂多壁碳纳米管(N-MWCNTs)合成。与碳纳米管相比，N-GNR具有反应性边界和固有的梯田和阶梯结构，可以增强化学活性和吸附能力。令人很意外的事，最后N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料不仅拥有了N-GNRs、Fe-MOFs和AuNPs的优点，还在导电性方面显示出显著的综合效应。因此，该新型纳米复合材料应用于本电化学免疫传感器的基底修饰以进一步增强传感器的灵敏度和稳定性。本专利技术基于AuPt-MB纳米复合材料构建新型纳米信号探针和N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料作为免疫传感器的基底修饰材料，建立了一种用于血清中galectin-3(Gal-3)浓度检测的电化学传感器制备方法与应用，为引发2型糖尿病的胰岛素抵抗提供早期的诊断依据。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种用于血清中galectin-3(Gal-3)浓度检测的电化学传感器制备方法及应用，其特征在于包括以下步骤：(1)氮参杂石墨烯纳米带(N-GNRs)-铁金属有机框架(Fe-MOFs)-金纳米粒(AuNPs)传感器基底修饰纳米复合材料的制备。(2)金铂双金属(AuPt)-亚甲蓝(MB)-Gal-3特异性检测抗体(Ab2)纳米信号探针的制备。(3)建立电化学免疫生物传感器，检测血清中Gal-3，绘制标准曲线。本专利技术所述N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs复合物的制备过程具体包括以下步骤，其特征在于包括以下步骤：(1)N-GNRs材料的制备：称取0.1g氮参杂多壁碳纳米管(N-MWCNTs)加入至10mL的H2SO4和H3PO4混合溶液中(H2SO4∶H3PO4＝9∶1)混匀。将上述混合溶液置于高压反应釜中在磁力搅拌条件下加热至140℃持续10min，再将反应混合溶液转移至65℃油浴中在搅拌条件下加入0.25gKMnO4持续反应8min。反应结束后控制溶液降温至室温，所得溶液经10000r/min，离心5min，用超纯水清洗3次。将所得沉淀置于真空干燥24h后，4℃保存备用。(2)Fe-MOFs材料的制备分别称取0.187gFeCl3·6H2O和0.126g2-氨基对苯二甲酸加入15mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，混匀。将上述混合溶液置于120℃硅油中加热4h，在开始加热后15min时，向混合溶液中加入200μL的冰醋酸。加热结束后控制溶液降温至室温，所得溶液经10000r/min，离心5min，分别用DMF，无水乙醇，超纯水各清洗3次。将所得沉淀置于真空干燥24h后，4℃保存备用。(3)Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料的制备取2mLHAuCl4·4H2O(1％)溶液加入到制备好的2mLFe-MOFs(1mgmL-1)溶液中，剧烈超声30分钟后，向上述溶液中逐滴缓慢加入4mLNaBH4(0.1M)同时放在磁力搅拌器上进行搅拌反应30min，所得溶液经10000r/min，离心5min，用超纯水清洗3次。将所得沉淀再分散至4mL的去离子水中，4℃保存备用。(4)N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料的制备称取0.2mgN-GNRs超声溶解于2mL的去离子水中，将其与4mLFe-MOFs@AuNPs复合物溶液超声混匀30min，在磁力搅拌500r/min条件下，搅拌过夜。所得溶液经8000r/min，离心5min，用超纯水清洗3次。将所得沉淀再分散至4mL的去离子水中，4℃保存备用。本专利技术所述AuPt-MB-Ab2纳米信号探针的制备过程具体包括以下步骤，其特征在于包括以下步骤：(1)AuPt-MB纳米复合材料的制备：分别取600μLHCL(0.1M)和6mL十二烷基三甲基溴化铵(DTAB1.14mM)加入至1mL的MB(9.8mM)溶液中，剧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于血清中galectin‑3(Gal‑3)浓度检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)氮参杂石墨烯纳米带(N‑GNRs)‑铁金属有机框架(Fe‑MOFs)‑金纳米粒(AuNPs)传感器基底修饰纳米复合材料的制备。(2)金铂双金属(AuPt)‑亚甲蓝(MB)‑Gal‑3特异性检测抗体(Ab2)纳米信号探针的制备。(3)建立电化学免疫生物传感器，检测血清中Gal‑3，绘制标准曲线。
【技术特征摘要】
1.一种用于血清中galectin-3(Gal-3)浓度检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)氮参杂石墨烯纳米带(N-GNRs)-铁金属有机框架(Fe-MOFs)-金纳米粒(AuNPs)传感器基底修饰纳米复合材料的制备。(2)金铂双金属(AuPt)-亚甲蓝(MB)-Gal-3特异性检测抗体(Ab2)纳米信号探针的制备。(3)建立电化学免疫生物传感器，检测血清中Gal-3，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs复合物的制备过程具体包括以下步骤，其特征在于包括以下步骤：(1)N-GNRs材料的制备：称取0.1g氮参杂多壁碳纳米管(N-MWCNTs)加入至10mL的H2SO4和H3PO4混合溶液中(H2SO4∶H3PO4＝9∶1)混匀。将上述混合溶液置于高压反应釜中在磁力搅拌条件下加热至140℃持续10min，再将反应混合溶液转移至65℃油浴中在搅拌条件下加入0.25gKMnO4持续反应8min。反应结束后控制溶液降温至室温，所得溶液经10000r/min，离心5min，用超纯水清洗3次。将所得沉淀置于真空干燥24h后，4℃保存备用。(2)Fe-MOFs材料的制备分别称取0.187gFeCl3·6H2O和0.126g2-氨基对苯二甲酸加入15mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，混匀。将上述混合溶液置于120℃硅油中加热4h，在开始加热后15min时，向混合溶液中加入200μL的冰醋酸。加热结束后控制溶液降温至室温，所得溶液经10000r/min，离心5min，分别用DMF，无水乙醇，超纯水各清洗3次。将所得沉淀置于真空干燥24h后，4℃保存备用。(3)Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料的制备取2mLHAuCl4·4H2O(1％)溶液加入到制备好的2mLFe-MOFs(1mgmL-1)溶液中，剧烈超声30分钟后，向上述溶液中逐滴缓慢加入4mLNaBH4(0.1M)同时放在磁力搅拌器上进行搅拌反应30min，所得溶液经10000r/min，离心5min，用超纯水清洗3次。将所得沉淀再分散至4mL的去离子水中，4℃保存备用。(4)N-GNRs-Fe-MOFs@AuNPs纳米复合材料的制备称取0.2mgN-GNRs超声溶解于2mL的去离子水中，将其与4mLFe-MOFs@AuNPs复合物溶液超声混匀30min，在磁力搅拌500r/min条件下，搅拌过夜。所得溶液经8000r/min，离心5min，用...
【专利技术属性】
技术研发人员：于超，唐志勇，陈俊，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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