一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法技术

本发明专利技术涉及一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，属于解磷菌的应用技术领域。所述的解磷菌固体菌剂以甘蔗渣为载体、海藻酸钠为保护剂、磷酸氢钙为粘结剂，制作过程依次包括解磷菌活化、解磷菌发酵培养、菌悬液制备、固体菌剂制作和菌株活力测定。本发明专利技术所述的解磷菌菌株为解淀粉芽孢杆菌，环境适应能力强。本发明专利技术以甘蔗渣为载体不仅实现了废弃植物生物质的资源化利用，而且原料廉价易得可降解。本方法制成的固体菌剂经长时间保存后解磷菌仍保持较高活性，施入土壤后解磷菌能够提高土壤中难溶性磷的利用效率，甘蔗渣还可增加土壤中有机质的含量，具有良好的应用潜力。

A method of making high energy phosphate carrier with bagasse as solid inoculant

【技术实现步骤摘要】
一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法
本专利技术属于解磷菌的应用
，具体涉及一株解磷芽孢杆菌和以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法。
技术介绍
磷是植物生长所必需的主要营养元素，但由于土壤中的磷会被土壤中的钙、铝、铁离子和有机化合物所固定，使土壤磷缺乏成为限制农产品产量和质量的重要因素。我国土地缺磷现象尤为严重，然而磷肥的大量使用并没有缓解土壤缺磷的状况，作物对磷肥的利用效率很低，大部分的磷被固定在土壤中，形成难以被植物吸收利用的难溶性磷酸盐。解磷微生物能将土壤中难溶性的磷转化为有效态磷，从而提高土壤中有效磷含量，供植物吸收利用，并减少化肥使用量以缓解环境污染。其中芽孢杆菌具有极强的抵抗寒冷、干旱、高温、营养缺乏等抗性，生长迅速，解磷能力高等优点，是具有工业化生产潜力的菌株之一。但是，未经保护的芽孢杆菌对环境因子变化敏感，容易被生态系统淘汰，同时液态型菌剂活菌数下降速度快、储藏时间短、运输携带不方便、易受杂菌污染，因此需要采取措施对其进行保护。而固态菌剂具有活菌数高、便于储藏与运输、施用简单、抵抗不良环境能力强的特点，因此有必要将解磷菌发酵液制作成固体形态，且载体及其与保护剂、粘结剂的组合效果对固体菌剂的性能起着至关重要的作用。
技术实现思路
针对解磷菌菌液活菌数下降速度快、储藏时间短、运输施用不便的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种解磷芽孢杆菌和以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法。本方法制成的固体菌剂经长时间保存后解磷菌仍保持较高活性，施入土壤后不仅能够提高土壤中难溶性磷的利用效率，还可增加土壤中有机质的含量。本专利技术采用的技术方案：一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，将解磷菌PC06(解淀粉芽孢杆菌)菌悬液与作为保护剂的5％海藻酸钠按照体积比1:1-10:1混合并快速搅拌；再将含有海藻酸钠的菌液与作为载体的甘蔗渣按照体积质量比2.5:1混合并搅拌均匀；最后添加2％磷酸氢钙溶液作为粘结剂，其中菌悬液与2％磷酸氢钙溶液的体积比为1:2-1:1；将所有物料搅拌均匀后，在25℃-35℃的室温条件下自然晾干；当物料含水率低于10％时，停止干燥过程，获得以甘蔗渣为载体的解磷菌固体菌剂。本技术方案的效果是：1、本方法制成的固体菌剂经长时间保存后解磷菌仍保持较高活性，克服了液态解磷菌活菌数下降速度快、储藏时间短、运输施用不便的缺陷，固体菌剂施入土壤后不仅能够提高土壤中难溶性磷的利用效率，还可增加土壤中有机质的含量，具有较强的应用潜力。2、采用甘蔗渣作为固体菌剂的载体不仅能够资源化利用农业废弃物，并且甘蔗渣可降解无污染，原料廉价易得，制作工艺简单。3、本方法制成的固体菌剂经长时间保存后解磷菌仍保持较高活性，施入土壤后解磷菌能够提高土壤中难溶性磷的利用效率，甘蔗渣还可增加土壤中有机质的含量，对于制作高活力固体解磷菌菌剂具有重要意义。附图说明图1为以甘蔗渣为载体制作解磷菌固体菌剂的不同实施例中活菌数量随储藏时间变化图。图2为不同保藏条件下解磷菌储藏30d时存活率对比图。具体实施方式本专利技术采用的技术方案：一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，包括如下步骤：S1：解磷菌PC06的活化：制备液体YPD培养基，在250mL三角瓶中加入100mLYPD培养基后接种100μl解磷菌PC06菌液，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养24h，获得解磷菌种子液。S2：解磷菌的扩大培养：将上述步骤S1中的解磷菌种子液以2％的接种量接入装有500mL液体YPD培养基的1L三角瓶中，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养3d，获得解磷菌发酵液。S3：菌悬液的制备：将上述步骤S2中培养好的解磷菌发酵菌液于5000rpm下离心10min后去掉上清液，再加入原发酵液体积10％的超纯水，在漩涡振荡器上震荡10min使菌体重悬浮，获得解磷菌PC06的菌悬液。S4：固体菌剂的制作：将上述步骤S3中的解磷菌菌悬液与作为保护剂的5％海藻酸钠按照体积比1:1-10:1混合并快速搅拌；再将含有海藻酸钠的菌液与作为载体的甘蔗渣按照体积质量比2.5:1混合并搅拌均匀；最后添加2％磷酸氢钙溶液作为粘结剂，其中菌悬液与2％磷酸氢钙溶液的体积比为1:2-1:1；将所有物料搅拌均匀后，在25℃-35℃的室温条件下自然晾干；当物料含水率低于10％时，停止干燥过程，获得以甘蔗渣为载体的解磷菌固体菌剂。S5：菌株活力的测定：将上述步骤S4中的解磷菌固体菌剂用密封袋封装，室温保存。进一步地，步骤S1中解磷菌PC06为解淀粉芽孢杆菌，其来源为采用无机磷固体培养基从某养猪场水泡粪沼渣中筛选获得，利用引物27F和1492R对菌株PC06进行扩增和双向测序，得到序列长度为1446bp，将序列信息输入NCBI数据库进行BLAST分析，其与JQ229807.1相似性达到99％，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。进一步地，步骤S4中，甘蔗渣粒径小于40目，甘蔗渣的主要组分纤维素、半纤维素、木质素和灰分的含量分别为35.4％-36.7％、32.9％-33.6％、14.0％-14.4％和3.1％-3.5％。以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1本专利技术所使用的解磷菌PC06经测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，本专利技术以甘蔗渣为载体、海藻酸钠为保护剂、磷酸氢钙为粘结剂制作解磷菌固体菌剂，具体步骤如下：(1)解磷菌PC06的活化：在250mL三角瓶中加入100mLYPD培养基后接种100uL解磷菌PC06菌液，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养24h，获得解磷菌种子液。(2)解磷菌的扩大培养：将上述步骤(1)中的解磷菌种子液以2％的接种量接入装有500mL液体YPD培养基的1L三角瓶中，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养3d，获得解磷菌发酵液。(3)菌悬液的制备：将上述步骤(2)中的250mL解磷菌发酵液于5000rpm下离心10min后去掉上清液，再加入原发酵液体积25mL的超纯水，在漩涡振荡器上震荡10min使菌体重悬浮，获得菌悬液。(4)固体菌剂的制作：将上述步骤(3)中的25mL菌悬液与10mL的5％海藻酸钠混合，用玻璃棒快速搅拌5min使菌体与海藻酸钠充分混匀；再将含有海藻酸钠的菌液与10g甘蔗渣混合，并使用玻璃棒搅拌均匀；随后添加25mL的2％磷酸氢钙溶液作为粘结剂，用玻璃棒将所有物料搅拌均匀后，在25℃-35℃的室温条件下自然晾干；当物料含水率低于10％时，停止干燥过程，获得以甘蔗渣为载体的解磷菌固体菌剂。(5)菌株活力的测定：将上述步骤(4)中的解磷菌固体菌剂用密封袋封装，室温保存，每隔一段时间采用稀释涂布平板法测定解磷菌的有效活菌数。测定方法为：在200mL三角瓶中加入0.5g固体菌剂、99.5mL无菌水和20粒玻璃珠，室温浸泡15min后，180r/min振荡30min制成200倍的均匀稀释液；取上述均匀稀释液1mL，注入含有9mL无菌水的试管中，振荡均匀；按上述操作依次做10倍递增稀释，直到稀释至所需浓度。取0.1mL适宜浓度的稀释液均匀涂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：解磷菌PC06的活化：在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养24h，获得解磷菌PC06种子液；S2：解磷菌的扩大培养：将步骤S1中的解磷菌种子液以2％的接种量接入，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养3d，获得解磷菌发酵液；S3：菌悬液的制备：将步骤S2中培养好的解磷菌发酵菌液于5000rpm下离心10min后去掉上清液，再加入原发酵液体积10％的超纯水，在漩涡振荡器上震荡10min使菌体重悬浮，获得解磷菌PC06的菌悬液；S4：固体菌剂的制作：将步骤S3中的解磷菌菌悬液与作为保护剂的5％海藻酸钠按体积比1:1‑10:1混合并快速搅拌；再将含有海藻酸钠的菌液与作为载体的甘蔗渣按体积质量比2.5:1混合并搅拌均匀；最后添加2％磷酸氢钙溶液作为粘结剂，其中菌悬液与2％磷酸氢钙溶液的体积比为1:2‑1:1；将所有物料搅拌均匀后，在25℃‑35℃的室温条件下自然晾干，当物料含水率低于10％时，停止干燥过程，获得以甘蔗渣为载体的解磷菌固体菌剂；S5：菌株活力的测定：将步骤S4中的解磷菌固体菌剂用密封袋封装，室温保存，每隔一段时间采用稀释涂布平板法测定有效活菌数。...

【技术特征摘要】
1.一种以甘蔗渣为载体制作高活力解磷菌固体菌剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：解磷菌PC06的活化：在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养24h，获得解磷菌PC06种子液；S2：解磷菌的扩大培养：将步骤S1中的解磷菌种子液以2％的接种量接入，在恒温摇床中于30℃、180r/min下培养3d，获得解磷菌发酵液；S3：菌悬液的制备：将步骤S2中培养好的解磷菌发酵菌液于5000rpm下离心10min后去掉上清液，再加入原发酵液体积10％的超纯水，在漩涡振荡器上震荡10min使菌体重悬浮，获得解磷菌PC06的菌悬液；S4：固体菌剂的制作：将步骤S3中的解磷菌菌悬液与作为保护剂的5％海藻酸钠按体积比1:1-10:1混合并快速搅拌；再将含有海藻酸钠的菌液与作为载体的甘蔗渣按体积质量比2.5:1混合并搅拌均匀；最后添加2...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖乃东，蒋蕊，周文兵，朱端卫，胡金龙，杨特武，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42