检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和在检测胰蛋白酶中的应用，该生物传感器包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2，磁纳米颗粒的表面修饰有羧基，多肽链2的表面加载有银纳米颗粒，多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA，多肽链1中含有精氨酸残基；磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附磁纳米颗粒，多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上，所多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。制备方法为：合成多肽链1‑磁纳米复合材料；合成加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液；组装生物传感器。本发明专利技术可实现对胰蛋白酶的特异性定性或定量检测，且检测限低，线性范围宽。

Biosensors for the detection of trypsin and the preparation and application of the biosensor

【技术实现步骤摘要】
检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于生物生物传感器
，具体涉及一种检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
胰蛋白酶是特异性最强的一种蛋白酶，在胰脏中是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。胰蛋白酶有着消化酶的功能，并且能够起活化的作用，例如限制分解一些酶的前体，磷脂酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶原等。测定血清胰蛋白酶对诊断急性胰腺炎有一定意义。随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,MNPs)在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣。磁性纳米颗粒是一类智能型的纳米磁性材料，既具有纳米材料所特有的性质如粒径小、比表面积大、偶连容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒被应用于生物标记与分离、核磁共振成像(MRI)、组织修复、药物载体以及疾病诊断与治疗等方面。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。由于多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构，多肽可以利用其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆积作用等有效实现分子自组装，通过非共价作用形成具有特定排列顺序的多肽聚集体。由于胰蛋白酶的特异性，可以针对蛋白质的序列中的某个片段进行定位切割，在实验中起着举足轻重的作用。因此，有望利用胰蛋白酶的上述特异性，构建多肽-磁性纳米颗粒生物生物传感器，检测血清中胰蛋白酶。但是目前还没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于多肽-磁性纳米颗粒检测胰蛋白酶的生物生物传感器及其制备方法和应用，可实现对目标物胰蛋白酶的特异性定性或定量检测，且检测限低，线性范围宽。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种检测胰蛋白酶的生物传感器，包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2，所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基，所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒，所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA，所述多肽链1中含有精氨酸残基；所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒，所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上，所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。本专利技术检测胰蛋白酶的原理为：当体系中没有目标物胰蛋白酶时，表面加载有银纳米颗粒的多肽链2可以与固定在磁性金电极表面的修饰有磁纳米颗粒(MNPs)的多肽链1通过末端序列VIA自组装连接，进而有很强的电化学信号。当体系中存在胰蛋白酶时，胰蛋白酶可以催化裂解多肽链1中的精氨酸残基的C端，使多肽链1含末端序列VIA的一段连同表面加载有银纳米颗粒的多肽链2一起脱离电极表面，电极上只剩下了经过切割后的多肽链1的部分序列，因而得到的电化学信号就降低了很多，且随着目标物浓度的增加，电化学信号逐渐降低。因此采用这样一个“信号降低”的方式可以实现胰蛋白酶的精确检测。优选的，所述多肽链1的序列为GGGAGRGVIA。优选的，所述多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL。优选的，所述磁纳米颗粒包括四氧化三铁磁纳米颗粒。作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)在表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应15～60min后，将反应液磁分离，去除上清液，加入溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液，反应1～5h后，将反应液磁分离，去除上清液，清洗后得到多肽链1-磁纳米复合材料；(2)避光条件下，在AgNO3溶液中加入多肽链2，磁力搅拌反应15～60min后，缓慢加入用冰水溶解的NaBH4，再反应5～30min，得到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液；(3)在磁性金电极的检测端滴加步骤(1)所得的多肽链1-磁纳米复合材料，待表面干燥后，浸入到步骤(2)所得的加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液中进行自组装反应，得到检测胰蛋白酶的生物传感器。优选地，所述步骤(1)中，所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液由以下方法制得：在70～90℃水浴及搅拌条件下，在除氧后的NaOH溶液中逐滴加入含FeSO4、FeCl3和HCl的混合溶液，持续除氧和搅拌15～60min后，迅速加入柠檬酸三钠溶液，并将水浴温度再升温5～20℃，持续除氧和搅拌30～90min后，将反应液磁分离，所得沉淀物清洗后用超纯水溶解，得到表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液。优选地，NaOH溶液、混合溶液、柠檬酸三钠溶液和超纯水的体积比为90mL∶9mL∶10mL∶50mL；所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.5M，所述混合溶液中，FeSO4的摩尔浓度为0.5M，FeCl3的摩尔浓度为1M，HCl的摩尔浓度为0.4M，柠檬酸三钠溶液的摩尔浓度为1.94M。优选地，所述步骤(1)中，所述溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液中，多肽链1的浓度为2μM；所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液与溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液的体积比为900μL∶100μL。优选地，在检测溶解有无目标物胰蛋白酶的缓冲溶液的条件下，磁纳米颗粒最佳的浓度为2mg/ml，多肽链1-磁纳米复合材料的最佳浓度为2μm。优选地，所述步骤(3)中，所述自组装反应在金属浴条件下进行，金属浴温度为30～40℃，自组装时间为1～5h。作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的检测胰蛋白酶的生物传感器或上述的制备方法所制备的检测胰蛋白酶的生物传感器在检测血清中胰蛋白酶中的应用，具体操作方法包括以下步骤：以所述的检测胰蛋白酶的生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于稀释的含有胰蛋白酶的血清溶液中，反应30～90min后，通过电化学工作站检测出血清溶液中进行电化学反应时的电流大小，然后根据胰蛋白酶浓度对数值与还原电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定血清溶液中的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶浓度与还原电流变化的线性回归方程为：P＝5.469-0.712lgC(1)式(1)中，P为胰蛋白酶检测时的电流变化值，单位为nA；lgC为血清溶液中胰蛋白酶的浓度对数值，单位为μM；相关系数为R2＝0.996。优选地，胰蛋白酶检测线性范围为1ng/mL～100mg/mL，检测下线为0.032ng/mL。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术的的检测胰蛋白酶的生物传感器，可实现对目标物胰蛋白酶的特异性定性或定量检测，且具有较宽的检测范围，较低的检出限，可以应用于稀释后的血清样品分析，并可用于空白血清中胰蛋白酶的加标回收检测，具有很大的医疗检测应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1的检测胰蛋白酶的生物传感器的组装过程示意图。图2为本专利技术实施例1的检测胰蛋白酶的生物传感器检测胰蛋白酶的原理图。图3为反应体系中有无目标物胰蛋白酶时电化学电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测胰蛋白酶的生物传感器，其特征在于，包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2，所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基，所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒，所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA，所述多肽链1中含有精氨酸残基；所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒，所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上，所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。

【技术特征摘要】
1.一种检测胰蛋白酶的生物传感器，其特征在于，包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2，所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基，所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒，所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA，所述多肽链1中含有精氨酸残基；所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒，所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上，所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。2.根据权利要求1所述的检测胰蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述多肽链1的序列为GGGAGRGVIA。3.根据权利要求1或2所述的检测胰蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL。4.根据权利要求3所述的检测胰蛋白酶的生物传感器，其特征在于，所述磁纳米颗粒包括四氧化三铁磁纳米颗粒。。5.一种如权利要求1～4任一项所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)在表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应15～60min后，将反应液磁分离，去除上清液，加入用三氟乙醇溶解的多肽链1，反应1～5h后，将反应液磁分离，去除上清液，清洗后得到多肽链1-磁纳米复合材料；(2)避光条件下，在AgNO3溶液中加入多肽链2，磁力搅拌反应15～60min后，缓慢加入用冰水溶解的NaBH4，再反应5～30min，得到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液；(3)在磁性金电极的检测端滴加步骤(1)所得的多肽链1-磁纳米复合材料，待表面干燥后，浸入到步骤(2)所得的加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液中进行自组装反应，得到检测胰蛋白酶的生物传感器。6.根据权利要求5所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液由以下方法制得...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗向阳，朱小力，王兆寅，郁惠珍，王杨，朱志强，
申请(专利权)人：苏州健雄职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32