一种基于猪ERV 转座子插入多态性研发新型分子标记的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。该方法是利用ERV的LTR序列作为查询序列，在猪公开的基因组寻找插入位点；每个插入位点分别向上游和下游延伸300‑500个核苷酸序列，下载每条序列；将获得的序列去除冗余并进行多序列比对，每条插入位点序列保留300‑500个ERV插入位点侧翼区核苷酸序列和LTR序列；再根据获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物；利用所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。本发明专利技术可以为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分子标记。

A new method for developing new molecular markers based on the insertion polymorphism of porcine ERV transposon

The invention relates to the field of molecular biology and bioinformatics, in particular a method based on the development of a new molecular marker based on the insertion polymorphism of the pig ERV transposon. This method is used as a query sequence using the LTR sequence of ERV, find the insertion sites in the pig genome open; each insertion site respectively to the upstream and downstream extension of the 300 500 nucleotide sequences, each sequence will receive the download; remove the redundant sequences and multiple sequences, each sequence retains 300 insertion site 500 ERV insertion flanking region of nucleotide sequences and LTR sequences; then according to the sequence information of the primers were designed to obtain, to be verified as molecular marker primers; use the molecular markers to verify PCR primers of different varieties of the same species, or different individual DNA samples, select clear bands and expanding primers polymorphism, molecular mark. The invention can be used to identify the strains of pigs, and the marker assisted selection in breeding provides useful molecular markers.

【技术实现步骤摘要】
一种基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法
本专利技术涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。
技术介绍
DNA分子标记技术是一种以基因组DNA多态性为基础的新型遗传标记技术，是遗传变异在DNA水平上的直接反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。第一类：是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；第二类：是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记；第三类：是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。还存在其他类型的DNA标记，但他们是上述DNA标记类型的组合。例如，CAP为酶切扩增多态性DNA，其中PCR产物在扩增后要进行酶切消化。其中的引物对可以根据重复元件和AFLP引物或不同重复元件的序列来设计。转座子在生物基因组中广泛存在，是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的移动DNA序列，首先由Mc.Clintock于20世纪40年代在玉米染色体中发现，以后又陆续在细菌、真菌及昆虫等各种生物中发现。由于转座子能在其寄主的基因组中复制、移动，因此，像其它的突变源一样，转座子不仅促进了物种间基因组的分化，而且还产生了物种内丰富的遗传多样性,对物种、品种、亚种、品系形成发挥了重要作用。利用转座子插入多态性(TIP)建立新型分子标记技术在遗传进化研究中为我们理解高等生物基因组的进化提供了新视角，同时，TIP技术也成为生物多样性、遗传进化研究和分子育种的重要工具。人类转座子解析研究最为深入和广泛。研究表明：人类基因组中的活性转座子主要为L1、Alu和SVA，这些活性转座子在不同人群中产生了大量的多态，Witherspoon等学者(Witherspoon,D.J.etal.Genomeresearch23,1170-81(2013))仅对196个来源于不同地区和群体的人基因组分析时，一次就获得了5799个Alu插入位点，其中多态位点高达2524个。目前发现在人类基因组中至少有8350个TIP座位(Hancks,D.C.etal.Currentopinioningenetics&development22,191-203(2012))。鼠的TIP比人类更丰富，因为鼠的世代间隔短，且基因组中活性转座子更多，主要包括ERV(鼠内源性病毒)、L1、B1/SINE和B2/SINE。猪基因组学研究目前面临的主要挑战是虽然获得了大量数量性状变异的QTL，但缺乏足够密度的分子标记，难以进行基因精细定位，无法有效开展分子标记辅助选择。而TIP具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、共显性、基因组分布广泛、检测手段简单快速、重复性好和开发成本低等。并且相较其他标记的来源，ERV的插入对猪基因组结构、基因表达的影响大于SNP，微卫星等，因此基于猪ERV转座子插入多态研发的分子标记必将大大推动分子育种的进程和猪功能基因学的研究；同时，TIP分子标记应用于猪群体遗传学研究也将加深人类对猪生物多样性、起源进化和品种种质特性形成的理解和认识。
技术实现思路
本专利技术是针对现有分子标记的不足，基于猪ERV转座子在猪基因组上具有含量丰富，分布广泛，并且在不同的个体间存在插入多态性的特点提供一种研发分子标记的方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于猪ERV转座子的新型分子标记的获取方式，包括以下步骤：(1)利用ERV的LTR序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对寻找到的ERV的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余并进行多序列比对，每条插入位点序列保留300-500个ERV插入位点侧翼区核苷酸序列和LTR序列；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于ERV插入位点基因组侧翼序列中，另一侧引物位于ERV的LTR序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。其中，ERV家族的成员序列有差异，可以用任何一个作为查询序列，获得的位点都属于ERV转座子的插入位点。所述ERV的LTR核苷酸序列包括但不限于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQIDNo.16、SEQIDNo.17、SEQIDNo.18、SEQIDNo.19或SEQIDNo.20。上述方法的一个实例是：(1)利用ERV的LTR核苷酸序列SEQIDNo.1作为查询序列，在Ensembl数据和UCSC数据库对猪公开的考基因组进行比对(blat)搜索，寻找ERV在基因组上的插入位点，选取比对上的长度大于95％且相似度大于98％的比对位点，获得53个插入位点；(2)根据53个插入位点分别向上游和下游延伸300核苷酸，然后分别下载每条序列；共53条序列；(3)将获得的53条序列利用CD-HIT程序按照相似性95％进行合并，去除冗余，并进行多序列比对，每条插入位点序列保留300-500个ERV插入位点侧翼区核苷酸序列和LTR序列，最终获得37条序列。(4)截取ERV插入位点序列作为设计引物的模板，根据序列设计检测引物，其中使一侧引物位于ERV插入位点的基因组侧翼序列中，另一侧引物位于ERV的LTR序列中。(5)利用待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记，共获得23个标记，对应的引物名称，引物组合，引物序列如表1所示。其中，步骤(5)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：1)人工合成上述37对待验证分子标记引物；2)提取不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组；3)以不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术主要通过获取ERV插入位点序列，设计各位点检测引物，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得转座子插入情况，据此建立基于转座子插入多态性检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用ERV的LTR序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开的基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对步骤(1)寻找到的ERV的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300‑500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余并进行多序列比对，每条插入位点序列保留300‑500个ERV插入位点侧翼区核苷酸序列和LTR序列；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于ERV插入位点的基因组侧翼序列中，另一侧引物位于ERV的LTR序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。

【技术特征摘要】
1.一种基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用ERV的LTR序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开的基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对步骤(1)寻找到的ERV的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余并进行多序列比对，每条插入位点序列保留300-500个ERV插入位点侧翼区核苷酸序列和LTR序列；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于ERV插入位点的基因组侧翼序列中，另一侧引物位于ERV的LTR序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。2.根据权利要求1所述基于猪ERV转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征是：所述步骤(1)所述ERV的LTR序列包括但不限于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋成义，王伟，陈才，杨昆仑，张丽，沈丹，王赛赛，王宵燕，高波，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32