一种基于猪SINE 转座子插入多态性研发新型分子标记的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。该方法是利用SINE的核苷酸序列作为查询序列，在猪公开的基因组寻找插入位点；根据寻找到的每个插入位点，分别向上、下游延伸300‑500个核苷酸序列，下载每条序列；将获得的序列去除冗余；根据获得的序列信息设计检测引物；利用所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。本发明专利技术方法可以为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分子标记。

A new method for developing new molecular markers based on the insertion polymorphism of porcine SINE transposon

The invention relates to the field of molecular biology and bioinformatics, in particular a method based on the development of a new molecular marker based on the insertion polymorphism of the pig SINE transposon. This method is used as a query sequence using the nucleotide sequence of SINE, to find the insertion sites in the pig genome open; according to each to find the insertion site, respectively, to the downstream extension of 300 500 nucleotide sequences, each sequence will receive the download; sequence redundancy removal; according to the sequence information of the primers were designed to obtain the income; to verify the molecular marker of PCR primers of different varieties of the same species, or different individual DNA samples, select clear bands and expanding primers polymorphism, molecular marker. The method can be used for the identification of pig lines and the marker assisted selection in breeding to provide useful molecular markers.

【技术实现步骤摘要】
一种基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法
本专利技术涉及分子生物学和生物信息学领域，具体涉及一种基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法。
技术介绍
DNA分子标记技术是一种以基因组DNA多态性为基础的新型遗传标记技术，是遗传变异在DNA水平上的直接反映。相对于形态学标记、生物化学标记、细胞学标记，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。DNA分子标记技术记过历年来的发展，主要有以下几种标记，第一代分子标记技术：限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术，优点：RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。缺点：在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区。随机扩增多态DNA标记技术(RAPD)，优点：与RFLP相比，RAPD技术简单，DNA用量少，试验设备简单，不需DNA探针，设计引物简单，而且不需要同位素，安全性好。缺点：RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这事的遗传分析相对复杂，在基因定位，做连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度，Mg2+浓度，所以实验的重复性差。扩增片段长度多态技术(AFLP)，优点：它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内监测到大量位点，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记。缺点：AFLP对基因组纯度和反应条件较高，容易受DNA污染，操作技术难度大。用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。第二代分子标记技术，微卫星标记技术SSR，优点：具有很高的多态性,而且一般为共显性。缺点：工作量大，费用也高，实际应用少。第三代分子标记：单核苷酸多态性(SNP)优点：具有共显性，能获得的标记数量多，易于实现高通量。是基因组中最简单。最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。缺点：芯片成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。表达序列标签(EST)优点：成本低，操作简单。有助于人们从分子水平理解物种的多样性，并可利用其中感兴趣的序列信息。缺点：所获基因组信息不全，如不能体现出内含子，调控序列等在基因表达调控中重要的信息。转座子是一类在基因组上可以自由跳跃(复制或移位)的移动DNA序列，广泛存在于生物基因组中。由于转座子能在其寄主的基因组中复制、移动，因此，能在基因组上产生转座子插入多态性(Transposoninsertionpolymorphisims，TIP)，对物种、品种、亚种、品系形成发挥了重要作用。利用转座子插入多态性(TIP)建立的新型分子标记技术在遗传进化研究中的应用为我们理解高等生物基因组的进化提供了新视角。猪基因组学研究目前面临的主要挑战是虽然获得了大量数量性状变异的QTL，但缺乏足够密度的分子标记，难以进行基因精细定位，无法有效开展分子标记辅助选择。而TIP具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、共显性、基因组分布广泛、检测手段简单快速、重复性好和开发成本低等。并且SINE具有一定长度，检测难度小于SNP，微卫星等，并且在猪基因组中分布广泛，通过本专利的方法设计的SINE标记，可以简便快捷的检测插入多态性，并且可以确定是纯合还是杂合状态。同时SINE转座子插入多态研发的分子标记必将大大推动分子育种的进程和猪功能基因学的研究。
技术实现思路
本专利技术是针对现有分子标记的不足，基于猪SINE转座子在猪基因组上具有含量丰富，分布广泛，并且在不同的个体间存在插入多态性的特点提供一种研发分子标记的方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于猪SINE转座子的新型分子标记的获取方式，包括以下步骤：(1)利用SINE的核苷酸序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对寻找到的SINE的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于SINE插入位点的5’端基因组侧翼序列中，另一侧引物位于SINE的3’端基因组侧翼序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。其中，SINE家族的成员序列有差异，可以用任何一个作为查询序列，获得的位点都属于SINE转座子的插入位点。所述SINE的核苷酸序列包括但不限于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQIDNo.16或SEQIDNo.17。上述方法的一个实例是：(1)利用SINE的核苷酸序列SEQIDNo.1作为查询序列，在Ensembl数据和UCSC数据库对猪公开的考基因组进行比对(blat)搜索，寻找SINE在基因组上的插入位点；(2)在各插入位点分别向上游和下游延伸300核苷酸，然后选择比对上的长度大于95％，相似度大于98％的位点，并分别下载每条序列；(3)将获得的序列利用CD-HIT程序按照相似性95％进行合并，去除冗余，最终获得78条序列。(4)截取由SINE5’端基因组侧翼序列、自身序列及3’端基因组侧翼序列组成的序列作为设计引物的模板，根据序列设计检测引物，其中使一侧引物位于SINE插入位点的5’端基因组侧翼序列中，另一侧引物位于SINE的3’端基因组侧翼序列中，最后获得78对待验证分子标记引物。(5)利用待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记，共获得44个标记，对应的引物名称，引物组合，引物序列如表1所示。其中，步骤(5)中PCR扩增的操作可以是包括以下步骤：1)人工合成上述44对待验证分子标记引物；2)提取不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组；3)以不同品种的池DNA以及不同品种的不同个体基因组为模板进行PCR扩增；4)对PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术主要通过获取SINE插入位点序列，设计各位点检测引物，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳等步骤获得转座子插入情况，据此建立基于转座子插入多态性检测方法。为猪的品系鉴定，育种中的标记辅助选择提供有用的分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用SINE的核苷酸序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开的基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对步骤(1)寻找到的SINE的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300‑500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于SINE插入位点的5’端基因组侧翼序列中，另一侧引物位于SINE的3’端基因组侧翼序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。

【技术特征摘要】
1.一种基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用SINE的核苷酸序列作为查询序列，在生物学公用数据库中对猪公开的基因组进行检索，寻找插入位点；(2)针对步骤(1)寻找到的SINE的每个插入位点，分别向上游和下游延伸300-500个核苷酸序列，然后分别下载每条序列；(3)将步骤(2)获得的序列去除冗余；(4)根据步骤(3)获得的序列信息设计检测引物，作为待验证分子标记引物，其中使一侧引物位于SINE插入位点的5’端基因组侧翼序列中，另一侧引物位于SINE的3’端基因组侧翼序列中；(5)利用步骤(4)所得的待验证分子标记引物PCR扩增不同品种，或同一品种不同个体基因组样品，选取能清晰扩出条带且有多态性的引物组合，获得分子标记。2.根据权利要求1所述基于猪SINE转座子插入多态性研发新型分子标记的方法，其特征是：所述步骤(1)所述SINE的核苷酸序列包括但不限于SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋成义，陈才，王伟，杨昆仑，张丽，沈丹，王赛赛，王宵燕，高波，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32