在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途制造技术

本发明专利技术涉及在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途。具体而言，本发明专利技术提供的融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。本发明专利技术还涉及所述融合蛋白的编码序列，含所述编码序列的多核苷酸序列，含所述多核苷酸序列的核酸构建物，相应的宿主细胞，在细胞内产生点突变的方法，以及试剂盒等。采用本发明专利技术，能实现定点突变的同时，在特定的基因区获得高的突变效率和多种突变组合。

Fusion protein, preparation and use of point mutation in cells

The present invention relates to a fusion protein that produces point mutations within a cell, and its preparation and use. Specifically, the fusion protein provided by the invention contains cytosine deaminase and nuclease activity deficiency, keeps the Cas enzyme that understands the activity of the spin enzyme, or is formed by the activity of cytosine deaminase and nuclease, and keeps the Cas enzyme that keeps the enzyme activity known. The invention also relates to the coding sequence of the fusion protein, polynucleotide sequences containing the coding sequence, nucleic acid constructs containing the polynucleotide sequences, corresponding host cells, methods for producing point mutations in cells, and reagent kits. The present invention can achieve fixed point mutation and obtain high mutation efficiency and multiple mutation combinations in specific gene regions.

【技术实现步骤摘要】
在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途
本专利技术涉及在细胞内产生点突变的融合蛋白、其制备及用途。
技术介绍
基因型与表型间存在密切关系。自然界中，自发突变会引起基因型的改变，从而产生多种表型。实验室中，仍然通过突变，使基因多样化，产生多种表型，从而筛选出功能突变体，研究基因与功能的相关，获得功能更强的蛋白质。自然界中，自发突变频率极低。常见生物中，人类基因组的自发突变率为5.0×10-10，小鼠基因组自发突变率为1.8×10-10，大肠杆菌基因组的自发突变率为5.4×10-10，HIV的自发突变率为3×10-5，随着生物基因组的减小，生物体的自发突变频率增高〔HolmesEC.Thecomparativegenomicsofviralemergence[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(4):1742-1746〕。但这种低水平的基因突变频率不能产生足够数量的表型，用以研究基因、表型与功能的关系。为了提高基因突变频率，实验室现有手段主要分体内突变方法和体外突变方法。体内点突变方法：1.物理方法：紫外辐射，突变频率为1×10-10〔PackerMS,LiuDR.Methodsforthedirectedevolutionofproteins[J].NatureReviewsGenetics,2015〕。2.化学方法：ENU是一种烷化剂，将乙基转移到DNA的氧和氮原子上，引起错配，碱基置换或者缺失，突变频率为1-1.5×10-5〔FILBY.ZEBRAFISH:METHODSANDPROTOCOLS.METHODSINMOLECULARBIOLOGY‐ByG.J.Lieschke,A.COatesandK.Kawakami.[J].JournalofFishBiology,2010,76(7):1874-1876〕。虽然ENU易于获得，但它对光、热、PH都很敏感，限制了它的应用。这两种方法均可以通过剂量改变其突变频率，但引起的点突变是随机的，突变频率低，突变图谱不均一，对生物体有害〔GuénetJL.Chemicalmutagenesisofthemousegenome:anoverview[J].Genetica,2004,122(1):9-24〕。3.生物方法：转座子，染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位，可引起插入突变，可以通过基因的插入导致基因敲除，基因激活，并可以通过选择不同载体来选择不同的插入位点，但其突变亲率比ENU低，在每一细胞周期中，只能发生3×10-5插入事件，并且需要host同时表达转座酶来完成转座〔KitadaK,IshishitaS,TosakaK,etal.Transposon-taggedmutagenesisintherat.[J].NatureMethods,2007,4(2):131-133〕。而在免疫系统，生发中心的B细胞，可以通过体细胞高频突变产生多样性抗体，抵抗病原的入侵〔OdegardVH,SchatzDG.Targetingofsomatichypermutation.[J].NatureReviewsImmunology,2006,6(8):573-583〕。体细胞高频突变指的是免疫球蛋白重轻链可变区的非模板点突变，与B细胞亲和成熟有关〔OdegardVH等，同前〕。而介导这一过程重要的酶是激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(activationinducedcytosinedeaminase，AID)。AID是一种胞嘧啶脱氨酶，属于APOBEC家族，一种RNA编辑酶家族：N端有核定位信号，C端有核输出信号，其催化结构域为APOBEC家族所共有〔ZhenmingX,HongZ,PoneEJ,etal.Immunoglobulinclass-switchDNArecombination:induction,targetingandbeyond.[J].NatureReviewsImmunology,2012,12(7):517-31〕。一般认为N端结构为SHM所必须。AID的表达局限于生发中心的B细胞，其发挥点突变功能是有条件的，必须作用于单链的DNA,并且具有序列偏好性，hotspot结构域为RGYW〔KiyotsuguY,Il-MiO,TomonoriE,etal.AIDEnzyme-InducedHypermutationinanActivelyTranscribedGeneinFibroblasts[J].Science,2002,296(5575):2033-2036〕。R代表A/G，Y代表C/T，W代表A/T，可见AID发挥功能与DNA的一级结构有关。首先将单链DNA上的胞嘧啶脱氨基变为U,形成U-G错配，如果U-G未修复，在DNA复制过程中会形成C-TG-A的转换突变。此外，U可被UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)切除，形成无嘧啶位点，将四种碱基随机参入〔OdegardVH等，同前〕。以上过程产生的点突变对于体细胞高频突变意义重大，可以产生多样性的抗体。但其在体内引起的点突变频率为1×10-4-1×10-3，且位点具有随机性〔MasatoshiA,NesreenH,AndreS,etal.AccumulationoftheFACTcomplex,aswellashistoneH3.3,servesasatargetmarkerforsomatichypermutation.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(19):7784-7789〕，仍无法满足实验筛选突变体所需。
技术实现思路
本文第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶。在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。在一个或多个实施方案中，所述Cas酶选自：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。在一个或多个实施方案中，所述Cas酶的核酸酶活性部分缺失，使得所述Cas酶仅能造成DNA单链断裂；或所述Cas酶的核酸酶活性全部缺失，能引起DNA双链断裂。在一个或多个实施方案中，所述Cas酶为Cas9酶，选自：来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)、来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)，以及来自嗜热链球菌的Cas9(St1Cas9)。在一个或多个实施方案中，所述Cas酶为Cas9酶，该酶的两个核酸内切酶催化结构域Ru本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。

【技术特征摘要】
2016.06.15 CN 20161042351281.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶，或由胞嘧啶脱氨酶和核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性的Cas酶形成。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Cas酶的核酸酶活性全部缺失，无DNA双链断裂能力，或部分缺失，仅具有DNA单链断裂能力；和/或所述Cas酶选自：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式；优选地，所述Cas酶为Cas9酶，优选选自：来自化脓链球菌的Cas9、来自金黄色葡萄球菌的Cas9，以及来自嗜热链球菌的Cas9；和/或所述胞嘧啶脱氨酶为全长胞嘧啶脱氨酶、或其保留了酶活的片段或突变体，其中所述片段至少包括胞嘧啶脱氨酶的NLS结构域、催化结构域和APOBEC样结构域；和/或所述融合蛋白还包含以下序列中的一种或多种：接头，核定位序列，以及为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化而引入的氨基酸残基或氨基酸序列。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述Cas酶为Cas9酶，该酶的两个核酸内切酶催化结构域RuvC1和/或HNH发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活性；优选地，所述Cas9酶的RuvC1和HNH都发生突变，导致该酶核酸酶活性缺失、保留了解旋酶活；更优选地，所述Cas9酶的第10个氨基酸天冬酰胺突变为丙氨酸或其它氨基酸，第841位氨基酸组氨酸突变为丙氨酸或其它氨基酸；更优选地，所述Cas9酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2第42－1452所示，或如SEQIDNO:72第42-1419位氨基酸残基所示；和/或所述胞嘧啶脱氨酶的片段至少包含胞嘧啶脱氨酶的第9－182位氨基酸残基，例如至少包含第1－182位氨基酸；优选地，所述片段由第1－182位氨基酸残基组成，由第1－186位氨基酸残基组成，或由第1－190位氨基酸残基组成；或者，所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2第1457－1654位氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：常兴，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31